Composti naturali e loro derivati nella salute e nelle patologie

During my graduate studies I have been involved in two very different projects. The choice to be involved in two different programs was mainly due to the high risk of the first one, which was focused on finding a strategy to allow brain delivery of a promising mitochondria-targeted drug derived from a natural compound, acting as an inhibitor of the Kv1.3 channel. The Kv1.3 subpopulation located in the inner mitochondrial membrane (mitoKv1.3) plays important roles in cancer, and its inhibition leads to pro-apoptotic processes. PAPTP has been recently developed to preferentially inhibit mitoKv1.3, and was shown to drastically reduce tumor growth in mouse models of melanoma and pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), without severe side effects. Unfortunately, while effective also against glioma cells in vitro, it turned out to be inactive in vivo, because it is not able to cross the blood brain barrier (BBB). The aim of my project was thus to exploit brain-targeting peptides to allow PAPTP brain delivery. Angiopep2-PAPTP (An2-PAPTP) and TAT-PAPTP constructs were synthesized and tested in vivo. While research with TAT-PAPT was discontinued because of its toxicity, An2-PAPTP was characterized for its brain uptake, liver metabolism and tissue distribution. The results showed that it is able to cross the BBB, being detectable in the brain at 15 and 30 minutes after the injection. Conjugation to An2 thus represents a viable strategy to deliver PAPTP to the brain. However, surprisingly no An2-PAPTP has been detected in the brain of glioma-bearing mice. These results, supported by few evidence present in the literature, suggested that the pharmacokinetic of similar conjugates could be strongly affected by the presence of the tumor. Summarizing, conjugation to An2 represents a viable strategy to deliver PAPTP to the brain, overcoming the barrier which completely prevents its access when administered as such. The second project I worked on dealt with the pharmacological effects promoted by the natural compound pterostilbene in a murine model of diet-induced obesity. Obesity and related disorders are major and growing threat to global human health and is associated with an increased risk of ailments such as type-2 diabetes, chronic inflammation and neurodegeneration. Current pharmacological approaches are inadequate or dangerous, and a well-researched approach based on nutraceuticals would be highly useful. Pterostilbene (Pt; trans-3,5-dimethoxy-4’-hydroxystilbene) is a natural phenol showing remarkable biomedical activities similar to those of resveratrol. Its high bioavailability is a major advantage for possible biomedical applications. We evaluated the effects of long-term Pt administration in a murine model of diet-induced obesity. C57BL/6 mice were chronically fed a high-fat diet, +/- Pt supplementation (90 mg/kg bw/day) for 30 weeks. Analysis of the inguinal white adipose tissue (iWAT) showed that Pt increased the expression of genes involved in browning, selectively in the iWAT. These effects are similar to those observed during cold-induced browning and highlight the ability of Pt to exert beneficial effects in the prevention of obesity-associated metabolic alterations through the activation of responses similar to those observed in the physiological response to stimuli such as cold exposure. Another crucial aspect in obesity is the impact on brain autophagy, that is reported to be altered during obesity and neurodegeneration. Analysis of the brain from mice fed standard, HFD or HFD + Pt diet showed that HFD strongly affected the expression of genes involved in autophagy, lysosomal biogenesis and mitogenesis. The supplementation with Pt restored the expression of these genes. These effects represent the first step toward the study of Pt effects on the prevention of pathologies affecting the brain.

Durante il dottorato ho lavorato a due progetti diversi. Questa scelta è giustificata dall’elevato rischio di insuccesso del primo progetto, il cui scopo è stato sviluppare una strategia per ottenere il brain targeting di un promettente inibitore del canale Kv1.3, di origine naturale, in grado di accumularsi preferenzialmente nei mitocondri. La popolazione mitocondriale dei canali Kv1.3, localizzata nella membrana mitocondriale interna svolge un ruolo importante nei tumori. La loro inibizione porta all’attivazione di processi pro-apoptotici. PAPTP è un composto in grado di inibire preferenzialmente il mitoKv1.3. PAPTP è risultato efficace nel rallentare la crescita tumorale in modelli animali di PDAC e melanoma, risultando privo di effetti tossici. Nonostante la sua efficacia in colture cellulari di glioma, in vivo è inefficace perché non è in grado di attraversare la barriera emato-encefalica (BBB). Lo scopo del progetto è stato valutare l’utilizzo di peptidi per consentire il brain delivery di PAPTP. Angiopep2- (An2-) e TAT-PAPTP sono stati sintetizzati e testati in vivo. Gli esperimenti con TAT-PAPTP sono stati sospesi a causa dell’insorgenza di tossicità. È stato invece possibile caratterizzare l’accumulo cerebrale, il metabolismo epatico e la distribuzione tissutale di An2-PAPTP. I risultati hanno dimostrato che An2-PAPTP è in grado di raggiungere il cervello a 15 e 30 minuti dopo la somministrazione. La coniugazione con An2 rappresenta quindi una strategia promettente per il direzionamento di PAPTP al cervello. Tuttavia, An2-PAPTP non è stato riscontrato nel cervello e nel fegato, quando somministrato in un modello murino ortotopico di glioma. Questi risultati, sulla base di evidenze presenti in letteratura, suggeriscono che la farmacocinetica di questi coniugati può essere fortemente alterata dalla presenza del tumore. Il secondo progetto a cui ho lavorato ha riguardato lo studio degli effetti farmacologici promossi dal composto naturale pterostilbene, in un modello murino di obesità indotta da dieta. L’obesità è associata all’aumento del rischio di numerose patologie/alterazioni tra cui il diabete di tipo 2, infiammazione cronica e neurodegenerazione. Gli approcci farmacologici attualmente disponibili sono inadeguati o dannosi. Sarebbe quindi utile poter studiare un approccio basato su sostanze nutraceutiche. Lo pterostilbene (Pt) è un fenolo naturale con numerose applicazioni biomediche. Lo scopo dello studio è stato valutare gli effetti dell’integrazione di una dieta grassa (HFD) con Pt, per 30 settimane. L’analisi del tessuto adiposo inguinale (iWAT) ha dimostrato che Pt ha aumentato l’espressione di geni coinvolti nell’attivazione del browning, selettivamente in questo tessuto. Tali effetti sono simili a quelli osservati durante il browning indotto da esposizione a basse temperature. I risultati ottenuti mettono in evidenza la capacità di Pt di esercitare effetti benefici nella prevenzione delle alterazioni metaboliche attraverso l’attivazione di una risposta simile a quella fisiologicamente attivata durante la risposta a stimoli quali l’esposizione a basse temperature. Un altro aspetto importante riguarda gli effetti causati dall’obesità nel cervello, a livello della regolazione dell’autofagia. È stato infatti osservato che l’autofagia può essere alterata nel corso dell’obesità e delle patologie neurodegenerative. L’analisi dei cervelli ha evidenziato che la dieta grassa ha alterato l’espressione di geni coinvolti nella regolazione dell’autofagia, della biogenesi lisosomiale e della mitogenesi. L’integrazione con Pt ha prevenuto tali alterazioni. Complessivamente, gli effetti osservati rappresentano il punto di partenza per studi futuri volti ad indagare gli effetti di Pt nella prevenzione delle patologie che coinvolgono il cervello.