Studio della Patogenesi dell'Atassia di Friedreich, una Malattia Neurodegenerativa: un Approccio Molecolare, Biochimico e Cellulare Integrato

Friedreich’s ataxia (FRDA) is a cardio-neurodegenerative disease, resulting from a severe decrease of the mitochondrial protein frataxin (FXN). Several roles have been proposed for FXN, ranging from biogenesis of iron-sulfur clusters (ISCs) and heme (key redox cofactors of the mitochondrial respiratory chain), to iron-binding/storage and iron chaperone. All these functions are in agreement with the biochemical features that characterize FRDA patients’ cells, i.e. a deficit of proteins containing ISCs as cofactors, imbalance in iron homeostasis and increased susceptibility to oxidative stress. However, a definite relationship between FXN levels, ISCs assembly dysregulation and bioenergetics failure has not been established yet. In the first part of my research, lymphoblastoid cell lines (LCLs) from different FRDA patients, along with a LCL from a healthy control, were thoroughly analyzed in terms of mitochondrial phenotype. Defects in bioenergetics efficiency and in mitochondrial ultrastructure were disclosed, along with a reduced capability to assemble the respiratory complexes in supercomplexes (SCs), supramolecular structures which in healthy cells improve the overall mitochondrial respiration. It was found that, in healthy cells, FXN and key proteins of the ISCs assembly machinery are enriched in the mitochondrial cristae, the functional subcompartment housing the respiratory (super)complexes. On the contrary, in FRDA cells, while proteins belonging to the ISCs assembly machinery retain their association with the mitochondrial cristae as in healthy cells, part of the residual FXN moves towards the matrix. This evidence suggests that the mitochondrial ultrastructural changes observed in FRDA cells could be connected to the partial loss of FXN from the cristae to the matrix and that this displacement could in turn affect its functional interaction with the ISCs assembly machinery, as well as with the mitochondrial respiratory chain. The hypothesis of a functional interaction between FXN and the respiratory chain was further investigated and, taken together, the obtained results suggest an involvement of FXN in the assembly and/or stability of supercomplexes, especially those containing complex I. The second part of my research was dedicated to study the iron-binding properties of human FXN through different spectroscopic techniques. By means of fluorescence spectroscopy and circular dichroism, the behavior of FXN in the presence of ferrous and ferric iron has been investigated. Moreover, to gain more information about the potential structural changes of FXN promoted by iron-binding, it was taken advantage of an approach never used before in the study of FXN, i.e. SDSL-EPR spectroscopy. This technique is based on labeling cysteines in selected positions of the protein with paramagnetic probes allowing to detect, at local level, possible conformational changes of the backbone dynamics. The results obtained by the combination of SDSL-EPR, fluorescence and circular dichroism spectroscopies have allowed to shed light on the iron-binding properties of FXN, in relation to its possible physiological roles. Moreover, based on a recent in vitro study showing a direct interaction between yeast FXN and superoxide dismutases (SODs), enzymes involved in the cellular antioxidant defense, it was addressed by SDSL-EPR if also human FXN is potentially able to interact with human mitochondrial SOD2. EPR experiments, combined with fluorescence analyses and with an in silico approach, demonstrated that human SOD2 interacts with human FXN in vitro, supporting the hypothesis that FXN could also be involved in the protection against oxidative damage, which commonly characterizes FRDA disease.

L'atassia di Friedreich (FRDA) è una malattia cardio- e neurodegenerativa, dovuta a una riduzione dei livelli di fratassina (FXN), una proteina mitocondriale. Diversi ruoli sono stati proposti per FXN, dalla partecipazione alla biogenesi dei centri ferro-zolfo (ISCs, Iron Sulfur Clusters) e dell'eme (cofattori redox della catena respiratoria mitocondriale), all’attività di legame/stoccaggio o chaperone per il ferro. Tali funzioni sono in accordo con le caratteristiche biochimiche osservate nelle cellule dei pazienti affetti da FRDA, cioè un deficit di proteine contenenti ISCs come cofattori, un’alterata omeostasi del ferro e una maggiore suscettibilità allo stress ossidativo. Tuttavia, una chiara relazione tra i livelli di FXN, la deregolazione dell'assemblaggio degli ISCs e difetti bioenergetici non è stata ancora univocamente chiarita. Nella prima parte del mio progetto, è stato analizzato il fenotipo mitocondriale di linee cellulari linfoblastoidi (LCL) sia di pazienti affetti da FRDA che di un controllo sano. Sono stati osservati difetti nell'efficienza bioenergetica cellulare, un’ultrastruttura mitocondriale alterata e una ridotta capacità di associazione dei complessi respiratori in supercomplessi (SCs), strutture supramolecolari che, in condizioni fisiologiche, garantiscono di migliorare l’efficienza respiratoria mitocondriale. Si è scoperto che, nelle cellule sane, FXN e alcune proteine chiave del macchinario di assemblaggio degli ISCs sono arricchite nelle criste mitocondriali, il sub compartimento funzionale che ospita i (super)complessi respiratori; al contrario, nelle cellule FRDA, parte della FXN residua tende a traslocare in matrice, diversamente dalle proteine appartenenti al macchinario di assemblaggio degli ISCs. Questa evidenza suggerisce che i cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali osservati nelle cellule FRDA potrebbero essere correlati alla parziale traslocazione di FXN dalle criste e che ciò potrebbe influenzare l’interazione funzionale con il macchinario di assemblaggio degli ISCs, così come con la catena respiratoria. L'ipotesi di un'interazione funzionale tra FXN e la catena di trasporto elettronico è stata indagata ulteriormente e i risultati ottenuti suggeriscono un coinvolgimento di FXN nell'assemblaggio e/o nella stabilità dei supercomplessi, specialmente quelli contenenti il complesso I. La seconda parte del mio progetto è stata dedicata allo studio delle proprietà di legame del ferro di FXN umana attraverso l’utilizzo di diverse tecniche spettroscopiche, tra cui spettroscopia di fluorescenza e di dicroismo circolare. Per ottenere informazioni su potenziali cambiamenti conformazionali di FXN promossi dal legame con il ferro, si è inoltre ricorsi ad un approccio mai utilizzato prima nello studio di FXN, cioè la tecnica SDSL accoppiata alla spettroscopia EPR. Questa tecnica, basata sul labeling di cisteine con sonde paramagnetiche in specifiche posizioni, permette di rilevare, a livello locale, possibili cambiamenti conformazionali della proteina. I risultati ottenuti dalla combinazione di SDSL-EPR, fluorescenza e dicroismo circolare hanno permesso di far luce sulle proprietà di legame col ferro di FXN, in relazione ai suoi possibili ruoli fisiologici. Inoltre, sulla base di un recente studio in vitro che ha dimostrato un'interazione diretta tra FXN di lievito e le superossido dismutasi (SODs), enzimi coinvolti nella difesa contro lo stress ossidativo, tramite la medesima tecnica di SDSL-EPR, abbiamo valutato se anche FXN umana fosse in grado di interagire con SOD2, l'isoforma mitocondriale. Gli esperimenti EPR, combinati con analisi di fluorescenza e con un approccio in silico, hanno permesso di dimostrare che SOD2 interagisce con FXN umana in vitro, supportando quindi l'ipotesi di un coinvolgimento di FXN nella protezione dal danno ossidativo a livello cellulare.