Sviluppo di un modello murino di perfusione ex vivo dei polmoni per la ricerca in Trapiantologia

Background. Ex vivo lung perfusion (EVLP) is an alternative to static cold storage (SCS) for lung preservation in clinical lung transplantation. Its advantages include the possibility of assessing, reconditioning, and preserving for longer time the lungs prior to transplantation. This technology was introduced in the early years of 2000, and, since then, different devices and protocols were introduced into widespread clinical practice. However, several aspects of EVLP are still controversial; moreover, the potential of EVLP for organ reconditioning and regeneration is still largely unexplored. For these purposes, several investigators have created animal models of EVLP. Rat models of EVLP constitute a potentially invaluable tool for transplantation research, since they allow a higher number of experiments to be performed than with a large animal model, and a wide array of experimental treatments to be investigated. The aim of this project is to create a reliable experimental rat ELVP protocol for transplantation research, and to assess the role of albumin as an additive of EVLP perfusion solution. Methods. Rat heart-lung blocks were harvested from Sprague-Dawley rats after 1 hour of warm ischemia. Grafts were kept immersed for 1 hour in low-potassium dextran solution and then placed on EVLP for 3 hours and perfused with a low-potassium dextran solution, additioned or not with 70 g/L of albumin (EVLP and EVLP+albumin groups). Every 30 minutes perfused lungs were evaluated for gas exchange, dynamic lung compliance (Cdyn), and pulmonary vascular resistance (PVR). Control lungs, after harvest, were kept in low-potassium dextran solution at 4°C for 4 hours (SCS group). Lung injury was evaluated by wet/dry ratio, histology, immunohistochemistry and TUNEL assay. Results. A significant decrease in PVR was observed from 30 to 60 minutes of EVLP, while other lung function parameters remained stable throughout the 3 hours. No significant differences were observed in lung function parameters or in pathologic assessment between EVLP and EVLP+albumin groups. Pathologic specimens of lungs treated by EVLP, with or without albumin, were characterized by significantly higher edema score and apoptotic index (p <0.05), as compared to lungs preserved by SCS. Conclusions. This project describes the first institutional experience with a rat EVLP model which allows for safe preservation of rat lungs for 3 hours with stable lung function parameters. After an initial learning phase, consistent and reliable results were obtained. Albumin did not demonstrate to be an essential component of the perfusion solution; however, this result needs further testing for longer perfusion times and on different animal models. Pathologic findings suggest that, compared to SCS, EVLP may cause a higher extent of lung injury; which, if confirmed, should be acknowledged as an inherent limitation of this model.

Introduzione. La perfusione ex vivo dei polmoni (EVLP) è un’alternativa al trasporto in cella frigorifera (static cold storage, SCS) per la preservazione degli organi ai fini di trapianto. I suoi vantaggi includono la possibilità di valutare, ricondizionare e preservare più a lungo i polmoni prima del trapianto. Questa tecnologia è stata introdotta nei primi anni 2000, e, da allora, diversi dispositivi e protocolli per l’EVLP sono entrati a far parte della pratica clinica internazionale. Tuttavia, alcuni aspetti legati all’EVLP sono ancora controversi; inoltre, le potenzialità dell’EVLP nel ricondizionare e rigenerare gli organi rimangono ancora in larga parte da esplorare. Per dare risposta a questi quesiti, diversi investigatori hanno creato dei modelli animali di EVLP. Il modello murino di EVLP costituisce uno strumento estremamente utile per la ricerca in trapiantologia, poiché, rispetto all’animale di grande taglia, tramite esso è possibile realizzare un maggior numero di esperimenti, e testare un ampio ventaglio di approcci terapeutici. Lo scopo di questo progetto è creare una piattaforma sperimentale di EVLP nel ratto, e valutare il ruolo dell’albumina come componente di una soluzione di perfusione acellulare. Metodi. Blocchi cuore-polmone di ratto sono stati prelevati da ratti Sprague-Dawley dopo un’ora di ischemia calda. Gli organi sono stati immersi per un’ora in soluzione di preservazione, a 4°C, e successivamente connessi alla piattaforma EVLP per 3 ore e perfusi con una soluzione acellulare, a basso contenuto di potassio e a base di destrano, a cui sono stati aggiunti oppure no 70 gr/L di albumina, a seconda del gruppo sperimentale (EVLP e EVLP+albumina). Ogni 30 minuti i polmoni sono stati valutati per l’efficienza degli scambi gassosi, la compliance polmonare dinamica (Cdyn), e le resistenze vascolari polmonari (PVR). Il grado di danno polmonare è stato valutato istologicamente attraverso il rapporto wet/dry, istologia, immunoistochimica, e test TUNEL. Risultati. Tra i minuti 30 e 60 di EVLP è stata osservata una significativa riduzione delle PVR, mentre gli altri parametri di funzionalità polmonare sono rimasti stabili nell’arco delle 3 ore. Non sono state osservate differenze significative nei parametri di funzionalità polmonare o nella valutazione patologica tra i gruppi EVLP e EVLP+albumina. I campioni di tessuto dei polmoni sottoposti a EVLP, con o senza albumina, sono risultati caratterizzati da un grado significativamente maggiore di edema e da un maggior indice apoptotico (p<0.05), rispetto ai polmoni del gruppo SCS. Conclusioni. Questo Progetto descrive la prima esperienza istituzionale con un modello di EVLP murino, il quale consente la preservazione di polmoni di ratto per 3 ore in uno stato fisiologicamente attivo, con parametri di funzionalità polmonare stabili. Dopo una fase iniziale di apprendimento, la sperimentazione ha dato luogo a risultati affidabili e riproducibili. L’albumina non si è rivelata una componente indispensabile per la corretta riuscita della perfusione ex-vivo; tuttavia, questo risultato necessita di ulteriori test per periodi più lunghi e su differenti modelli animali. I risultati anatomopatologici suggeriscono che, a confronto con la preservazione in cella frigorifera, l’EVLP potrebbe dare luogo ad un danno polmonare di maggior entità, che, se confermato, dovrebbe essere tenuta in considerazione come un limite intrinseco del modello murino.