Mitochondrial calcium signaling in Duchenne Muscular Dystrophy

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked inherited neuromuscular disorder caused by mutations in the dystrophin gene, which lead to the absence of the protein in the muscle and to the instability of the dystrophin-associated protein complex (Hoffman et al. 1987; Mendell & Lloyd-Puryear 2013). The disease is characterized by progressive muscle wasting and loss of mobility, followed by a premature death for cardiac or respiratory complications (Coles et al. 2020). Due to altered sarcolemma permeability, cytosolic [Ca2+] is increased (Robert et al. 2001), which in turn triggers mitochondrial Ca2+ overload (Kelly-Worden & Thomas 2014), leading to altered oxidative metabolism, increased ROS production, opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) and eventually cell death (Burr & Molkentin 2015). The modulation of mitochondrial Ca2+ uptake is controlled by the Mitochondrial Calcium Uniporter (MCU), a multiprotein complex located in the inner mitochondrial membrane (De Stefani et al. 2011). MCU protein levels are increased in mdx mouse muscle compared to the wildtype counterpart, further contributing to mitochondrial Ca2+ overload. Thus, we hypothesized that restoring physiological mitochondrial Ca2+ levels in the mdx mouse could improve mitochondrial function and muscle performance. To this aim, we attempted to reduce MCU expression in newborn mdx mice by means of adeno-associated viral particles carrying a short hairpin RNA against MCU (AAV9-shMCU) or luciferase as control (AAV9-shLUC). However, the continuous cycles of degeneration and regeneration of the post-natal mdx muscle triggered the loss of AAV expression, and only the fibers that grew healthy until adulthood retained AAV expression. Thus, irrespectively of the transduced shRNA, AAV9 particles injected in the dystrophic newborn muscle were expressed mainly in terminally differentiated adult myofibers. Based on these observations, we chose an alternative strategy, based on the deletion of one MCU allele in the mdx background. Firstly, we characterized the skeletal muscle phenotype of Mcu+/- mice. Contrary to the deletion of both MCU alleles which impairs oxidative metabolism and triggers muscle atrophy (Gherardi et al. 2019), fiber size and mitochondrial activity were unaltered in Mcu+/- muscles. Nonetheless, due to a subtle metabolic defect, exercise performance was reduced in adult mice. In the mdx*Mcu+/- mouse model, the reduced expression of MCU protein and the consequent reduction in mitochondrial Ca2+ overload neither affected fiber size, nor the amount of regenerating myofibers. Nonetheless, serum creatine kinase levels were decreased in mdx*Mcu+/- mice compared to mdx controls, indicating a mild protection against muscle damage. Moreover, the reduced mitochondrial Ca2+ accumulation improved the motor skills of mdx*Mcu+/- mice compared to mdx controls. In conclusion, in dystrophic muscles, characterized by mitochondrial Ca2+ overload, a partial decrease of mitochondrial Ca2+ accumulation improves muscle performance without negatively affecting fiber size and oxidative metabolism.

La Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia neuromuscolare ereditaria legata al cromosoma X, in particolare al gene della distrofina. Mutazioni a carico della distrofina provocano l’assenza della proteina stessa nel muscolo, causando instabilità del complesso proteico associato ad essa (dystrophin-associated protein complex) (Hoffman et al. 1987; Mendell & Lloyd-Puryear 2013). La malattia è caratterizzata da una progressiva atrofia muscolare e perdita di mobilità, seguite da una morte prematura per complicanze cardiache o respiratorie (Coles et al. 2020). L’alterata permeabilità del sarcolemma causa un aumento della concentrazione di calcio citosolico (Robert et al. 2001), che a sua volta provoca un incremento di calcio mitocondriale (Kelly-Worden & Thomas 2014), portando ad un’alterazione del metabolismo ossidativo, ad un aumento della produzione di ROS, all’ apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTP) e infine alla morte cellulare (Burr & Molkentin 2015). La modulazione dell’entrata di calcio mitocondriale è controllata dell’uniporto mitocondriale del calcio (MCU), un complesso multiproteico situato nella membrana mitocondriale interna (De Stefani et al. 2011). I livelli proteici di MCU sono aumentati nel muscolo del topo mdx rispetto alla controparte wt, contribuendo ulteriormente al sovraccarico di calcio mitocondriale. Pertanto, abbiamo ipotizzato che il ripristino dei livelli fisiologici di calcio mitocondriale nel topo mdx potrebbe migliorare la funzione mitocondriale e la prestazione muscolare. A questo scopo, abbiamo tentato di ridurre l'espressione di MCU nei topi mdx neonati mediante l’uso di virus adenoassociati a cui è legato un RNA a forcina corta contro il gene MCU (AAV9-shMCU) o il gene della luciferasi come controllo (AAV9-shLUC). Tuttavia, i continui cicli di degenerazione e rigenerazione del muscolo mdx postnatale hanno causato la perdita dell'espressione di AAV e solo le fibre che sono cresciute sane fino all'età adulta hanno mantenuto l'espressione del virus. Pertanto, indipendentemente dallo shRNA, le particelle di AAV iniettate nel muscolo distrofico del neonato sono state espresse principalmente nelle fibre muscolari adulte differenziate. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo scelto una strategia alternativa, basata sulla delezione di un allele di MCU nei topi mdx. Inizialmente, abbiamo caratterizzato il fenotipo del muscolo scheletrico dei topi eterozigoti Mcu+/-. Contrariamente alla delezione di entrambi gli alleli MCU che altera il metabolismo ossidativo e causa atrofia muscolare (Gherardi et al. 2019), la dimensione delle fibre e l'attività mitocondriale sono rimaste invariate nei muscoli dei topi Mcu+/-. Tuttavia, a causa di un sottile difetto metabolico, la prestazione muscolare nei topi adulti è ridotta. Nel modello di topo mdx*Mcu+/-, la ridotta espressione proteica di MCU e la conseguente riduzione del sovraccarico di calcio mitocondriale non hanno influenzato né la dimensione delle fibre, né la quantità di fibre rigeneranti. Tuttavia, i livelli sierici di creatina chinasi sono diminuiti nei topi mdx*Mcu+/- rispetto ai controlli mdx, indicando una lieve protezione contro il danno muscolare. Inoltre, il ridotto accumulo di calcio mitocondriale ha migliorato le capacità motorie dei topi mdx*Mcu+/- rispetto ai controlli mdx. In conclusione, nei muscoli distrofici, caratterizzati da un aumento di calcio mitocondriale, una parziale diminuzione dell'accumulo di calcio mitocondriale migliora la prestazione muscolare senza influire negativamente sulla dimensione delle fibre e sul metabolismo ossidativo.