Microvasculopatia nella sclerosi sistemica: il ruolo del RNA non codificante H19X

Background: Systemic sclerosis (SSc) is an autoimmune disease characterized by inflammation, vasculopathy, and fibrosis of the skin and internal organs. Long non-coding RNAs (lncRNAs) are non-coding transcripts involved in the regulation of gene expression. This study aimed to characterize the functional relevance of H19X in SSc microvasculopahty Methods: H19X expression in SSc skin biopsies was computed on single–cell RNA–sequencing data (scRNA-seq). Analysis of differential expression of endothelial cell (EC) injury markers and pathway enrichment analysis (KEGG) between H19X expressing cells and H19X negative cells was carried out. The function of H19X was investigated in human dermal microvascular EC (HDMEC) by silencing, using locked nucleic acid antisense oligonucleotides (LNA GapmeRs). H19X expression was analyzed by qPCR after HDMEC stimulation with proinflammatory cytokines. Gene expression was measured by qPCR. Protein levels were analyzed by Western Blot. Endothelial adhesion was evaluated by co-culture of HDMEC and fluorescently labelled peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Phalloidin staining was used to study cell contractility. Results: scRNA-seq data showed a significant upregulation of H19X in SSc compared to healthy EC. In HDMEC, H19X was consistently induced by IFNα, IFNβ and IFNγ. Adhesion molecule VCAM1 was identified as its target, as H19X knockdown lead to a consistent and significant decrease both at mRNA and protein level. Moreover, activity of Rac1 and PAK, two downstream VCAM1 effectors, and VCAM1-induced cell contractility were also reduced following H19X knockdown. Correlation between adhesion molecules and H19X was confirmed by co – expression analysis and KEGG pathway analysis performed on ScRNA-seq data. The functional relevance of H19X on endothelial adhesion was confirmed by PBMCs with H19X silenced HDMEC, where it was demonstrated a significant decrease in leucocyte-to-endothelial cell adhesion. Conclusion: This study provides evidence for a functional role of lncRNA H19X in microvascular EC. By acting as a regulator of adhesion molecules, H19X contributes significantly to SSc – associated microvasculopathy.

Background: La sclerosi sistemica (SSc) è una patologia autoimmune caratterizzata da infiammazione, vasculopatia e fibrosi della cute e degli organi interni. Gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) sono trascritti non codificanti coinvolti nella regolazione dell'espressione genica. Questo studio è stato mirato caratterizzare la rilevanza funzionale di H19X nella microvasculopatia SSc Metodi: l'espressione di H19X è stata valutata su dati di sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq) su biopsie cutanee di SSc. Sono state eseguire analisi dell'espressione differenziale dei marcatori di danno delle cellule endoteliali (CE) e l'analisi di pathway (KEGG) tra cellule che esprimono e non esprimono H19X. La funzione di H19X è stata studiata nelle CE microvascolare dermica (HDMEC) mediante silenziamento, utilizzando oligonucleotidi antisenso (LNA GapmeRs). L'espressione di H19X è stata analizzata mediante qPCR dopo stimolazione con citochine proinfiammatorie. L'espressione genica è stata misurata mediante qPCR. I livelli di proteine sono stati analizzati mediante Western Blot. L'adesione endoteliale è stata valutata mediante co-coltura di HDMEC e leucociti marcati. La colorazione con falloidina è stata utilizzata per studiare la contrattilità cellulare. Risultati: i dati si scRNA-seq hanno mostrato una significativa sovraregolazione di H19X nelle CE da SSc rispetto ai controlli sani. Nelle HDMEC, H19X risultava indotto da IFNα, IFNβ e IFNγ. La molecola di adesione VCAM1 è stata identificata come bersaglio, poiché il knockdown H19X ne portava una diminuzione consistente e significativa sia a livello di mRNA che di proteine. Inoltre, anche l'attività di Rac1 e PAK, due effettori VCAM, così come la contrattilità cellulare indotta da VCAM1 sono state ridotte dopo il knockdown di H19X. La correlazione tra molecole di adesione e H19X è stata confermata dall'analisi di co-espressione e dall'analisi di pathway KEGG eseguita sui dati di ScRNA-seq. Una significativa riduzione dell’adesione endotelio – leucocitaria in seguito al silenziamento di H19X è stata dimostrata con studi funzionali Conclusione: questo studio fornisce evidenza di un ruolo funzionale di lncRNA H19X nella CE microvascolare. Agendo come regolatore delle molecole di adesione, H19X contribuisce in modo significativo alla microvasculopatia associata a SSc.