Photoexcited triplet state in EPR spectroscopy: characterization and application as spin label in distance determination

Molecular structure and dynamics are cardinal to the performance of macromolecules’ roles and their comprehension is fundamental in chemistry, biology and medicine. In the investigation of biological systems, Electron Paramagnetic Resonance (EPR) and, specifically, pulsed dipolar spectroscopy (PDS) are relevant for the absence of limitations to the dimension of the probed system and the possibility of determining distances and distance distributions between paramagnetic species in the nanometer range. For the application of EPR techniques paramagnetic species need to be present. These can be either endogenous or inserted as spin labels in macromolecules of interest. Conventionally radicals or metallic centres are used, but in the last years there has been interest in alternatives, and a novel spin label probe is the triplet state of photoexcited chromophores. Many organic molecules have a diamagnetic singlet ground state, which can be excited in the UV-visible range to an excited singlet state. From this by inter-system crossing (ISC) an excited triplet state, which is paramagnetic, can be populated. After a porphyrin triplet state was first employed as a spin label, the applicability of several chromophores for this purpose has been demonstrated and new pulse sequences that allow exploitation of their different characteristics have been developed. Photoexcited triplet states have peculiar characteristics, such as a large zero-field splitting anisotropy and a strong spin polarization due to the non-Boltzmann population of their sublevels by ISC. Many chromophores that can be excited to a triplet state are naturally present in molecular systems of interest and can be exploited as endogenous probes. The use of the triplet state as a spin label allows also many different applications. For example, it is possible to correlate their optical and magnetic properties through magnetophotoselection, a technique that combines the magnetic orientational selection due to the anisotropy of the triplet state and the probability of generating an excited state depending on the relative orientation of its transition dipole moment and the polarization plane of the light. The aim of this thesis is to investigate the possibilities of application of photoexcited triplet states as paramagnetic spin labels. The work is divided in three parts. Part I contains an introduction to EPR spectroscopy and the theoretical background on photoexcited triplet states. Part II is dedicated to the characterization of different chromophores in their triplet states. In Chapter 4 a MATLAB routine dedicated to the simulation of triplet state EPR spectra that has been employed for all the following work is described. Magnetophotoselection has been exploited to investigate the phototautomerism of free-base porphyrins in Chapter 5 and the nature of the excitonic coupling between chlorophyll moieties in the Water Soluble Chlorophyll-binding Protein in Chapter 6. Chapter 7 contains a study of the triplet state of the Zn protoporphyrin IX in solution and embedded in a protein. In Chapter 8, a co-facial porphyrin hetero-dimer, synthesized in the pursuit of the construction of a mimic of the special pair of Photosystem II, is studied via magnetophotoselection. Part III is devoted to the application of the photoexcited triplet state in PDS and the investigation of the hyperpolarization of stable radicals by the triplet state. Chapter 9 reports the first use of magnetophotoselection to introduce optical orientational selection in light-induced PDS. In Chapter 10, a flavin photoexcited triplet state is for the first time employed as an endogenous spin label in PDS. Chapter 11 is dedicated to the electron spin polarization transfer from photoexcited triplet states to weakly coupled radicals, which shows potential for sensitivity enhancement in EPR spectroscopy.

Struttura e dinamica molecolari sono essenziali per lo svolgimento del ruolo delle macromolecole e la loro comprensione è fondamentale in ambito chimico, biologico e medico. Nello studio di sistemi biologici la spettroscopia paramagnetica elettronica (EPR) e in particolare la spettroscopia impulsata dipolare sono rilevanti per l'assenza di limitazioni in funzione della dimensione del sistema e la possibilità di determinare distanze tra specie paramagnetiche nel range dei nanometri. Per l'applicazione di queste tecniche è necessaria la presenza di specie paramagnetiche, endogene o inserite in posizioni specifiche nella molecola di interesse. Tipicamente si utilizzano specie radicaliche o centri metallici, ma negli ultimi anni è stato proposto come alternativa lo stato di tripletto di un cromoforo fotoeccitato. Molte molecole organiche hanno uno stato fondamentale diamagnetico di singoletto, il quale per assorbimento di radiazione nel visibile può essere eccitato a uno stato di singoletto eccitato. Questo per inter-system crossing (ISC) può popolare uno stato eccitato di tripletto, paramagnetico. In seguito al primo utilizzo dello stato di tripletto di una porfirina come sonda paramagnetica in spettroscopia impulsata dipolare, nuovi cromofori sono stati proposti per questo scopo e nuove sequenze sono state sviluppate per permettere il loro sfruttamento ottimale. I tripletti fotoeccitati hanno proprietà distintive rispetto a radicali e centri metallici, quali una grande anisotropia dovuta all'interazione di zero field splitting e una forte polarizzazione dello spettro. Vari cromofori fotoeccitabili a stato di tripletto sono naturalmente presenti in sistemi biologici di interesse e possono essere utilizzati come sonde endogene. L'utilizzo dello stato tripletto come sonda paramagnetica permette anche applicazioni differenti. Ad esempio, è possibile correlarne proprietà ottiche e magnetiche mediante la magnetofotoselezione, tecnica che combina selezione orientazionale magnetica dovuta all'anisotropia dello stato di tripletto e la probabilità di generare uno stato eccitato in base all'orientazione relativa tra polarizzazione della luce e momento di dipolo di transizione della molecola eccitata. L'obiettivo di questa tesi è approfondire le possibilità di applicazione del tripletto fotoeccitato come sonda paramagnetica. Il lavoro è diviso in tre parti. La Parte I contiene un'introduzione alla spettroscopia EPR. La Parte II è dedicata alla caratterizzazione di stati di tripletto di cromofori. Nel Capitolo 4 è descritta una routine per MATLAB per la simulazione di spettri EPR di stati di tripletto. La magnetofotoselelezione è stata sfruttata per studiare la fototautomeria di porfirine nel Capitolo 5 e l'accoppiamento eccitonico di clorofille all'interno della proteina Water Soluble Chlorophyll-binding Protein nel Capitolo 6. Il Capitolo 7 contiene uno studio dello stato di tripletto della zinco protoporfirina IX in soluzione e all'interno di una struttura proteica. Nel Capitolo 8 la magnetofotoselezione è utilizzata per studiare un etero-dimero co-facciale di porfirine con potenziali applicazioni nella mimesi di sistemi fotosintetici. La Parte III è dedicata all'applicazione di stati di tripletto fotoeccitati come sonde paramagnetiche e allo studio dell'iperpolarizzazione di radicali stabili da parte di stati di tripletto. Il Capitolo 9 riporta il primo utilizzo della magnetofotoselezione per introdurre selezione orientazionale di natura ottica nella spettroscopia impulsata dipolare. Nel Capitolo 10, lo stato di tripletto fotoeccitato di una flavina viene impiegato per la prima volta come sonda paramagnetica endogena in spettroscopia impulsata dipolare. Il Capitolo 11 è dedicato allo studio di un trasferimento di polarizzazione da stati di tripletto fotoeccitati a radicali accoppiati debolmente, il quale ha potenzialità per l'aumento del segnale di specie con polarizzazione Boltzmann nella spettroscopia EPR.