Il ruolo di BCAT1 (Branched chain amino-acid transaminase 1) nella leucemia linfoblastica acuta a cellule T (LAL-T) indotta da NOTCH1

T-cell acute lymphoblastic leukaemia (T-ALL) is an aggressive blood cancer resulting from abnormal proliferation of immature T-cell progenitors. The cytosolic branched chain amino acid transaminase (BCATc), also known as BCAT1, has been extensively reported to be required for cell proliferation and viability in different tumours, including several type of blood malignancies. However, the role of BCAT1 in T-ALL has not been yet investigated. In the context of T-ALL, we have found BCAT1 being differentially and highly expressed in a panel of T-ALL samples at both mRNA and protein levels as compared to normal thymocytes. Interestingly, our analysis in cohorts of well-characterized T-ALL patients revealed that activation of the NOTCH1 pathway via NOTCH1 or FBXW7 mutations correlates with higher BCAT1 expression levels as compared to NOTCH1 wild type T-ALL samples. Activating mutations in the NOTCH1 ligand-activated transcription factor oncogene were found in over 60% of T-ALL cases, but attempts to directly inhibit NOTCH1 presented several difficulties. We found that NOTCH1 inhibition determined a significant BCAT1 down-regulation in several T-ALL samples. Notably, Chromatin Immunoprecipitation experiment along with the luciferase assays we demonstrated that NOTCH1 binds directly to the BCAT1 promoter, stimulating its transcription. To better characterize the role of BCAT1 and the possible metabolic mechanisms associated with its pro-tumorigenic phenotype, we took advantage of a mouse models of T-ALL, which are strictly dependent on oncogenic NOTCH1, generated by retrovirus-mediated overexpression of activated NOTCH1 alleles (L1601P-∆PEST or ΔE-NOTCH1) in hematopoietic lineage negative (Lin-) progenitors. We found that Bcat1 is over-expressed in NOTCH1 dependent murine T-ALL cells compared to normal thymocytes. Further, inhibition of NOTCH1 signalling with a gamma secretase inhibitor (GSI) in murine T-ALL cells in vivo determined down-regulation of Bcat1 expression. Finally, preliminary metabolomics experiments revealed that, following DBZ treatment of murine T-ALL in vitro, the levels of leucine, isoleucine and their derived Branched Chain Keto amino acid (BCKAs) were significantly reduced, suggesting that BCAT1 enzymatic activity is affected following NOTCH1-inhibition and may contribute to the oncogenic function of NOTCH1. Given these results, we generated a Bcat1 knockout mouse model to establish whether Bcat1 loss could hamper NOTCH1-induced leukaemia. Our analysis showed that the absence of Bcat1 did not affect T-cell development and the various lymphoid tissues analysed were similar in weight and cellularity respect to wild type (wt) mice. Importantly, our preliminary data demonstrated that Bcat1 loss significantly extended survival in leukemic mice transplanted with T-cell progenitors transduced with oncogenic NOTCH1 allele respect to wt T-cell progenitors. In summary, our findings highlight a context specific role of BCAT1 in T-ALL and strongly suggest that targeting BCAT1 may be a promising target for NOTCH1-mutated T-ALL patients.

La leucemia linfoblastica acuta a cellule T (LAL-T) è un tumore ematologico aggressivo derivante dalla proliferazione incontrollata dei progenitori immaturi delle cellule T. Negli ultimi anni, l’enzima responsabile della transaminazione degli aminoacidi a catena ramificata, noto come BCAT1 (branched chain amino acid transaminase 1) è stato ampiamente studiato in quanto coinvolto nei processi di tumorigenesi in differenti tumori solidi ed ematopioetici. Tuttavia, il ruolo di BCAT1 in LAL-T non è stato ancora studiato. In analogia con altre forme tumorali, l’espressione di BCAT1 è risultata significativamente over espressa nei campioni di LAL-T sia ai livelli della proteina che del mRNA rispetto ai timociti (controparte normale). Inoltre, la nostra analisi in coorti di pazienti LAL-T ben caratterizzati a livello molecolare ha rivelato che l'attivazione oncogenica di NOTCH1 a causa di mutazioni attivanti correla con livelli di espressione BCAT1 più elevati rispetto ai campioni non mutati. Le mutazioni attivanti a carico dell’oncogene NOTCH1 si trovano in oltre il 60% dei casi della LAL-T, ma i tentativi di inibire direttamente questo fattore di trascrizione hanno presentato parecchie difficoltà. Le nostre analisi hanno evidenziato che l'inibizione di NOTCH1 determinava una significativa diminuzione dell’espressione di BCAT1 in diversi campioni di LAL-T sostenendo l'ipotesi che BCAT1 potesse essere un gene direttamente regolato da NOTCH1. In particolare, attraverso esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina e saggi dell’attività luciferasica abbiamo confermato le nostre ipotesi e dimostrato che NOTCH1 interagendo direttamente con il promotore di BCAT1 va a stimolarne la sua trascrizione nella LAL-T. Pertanto, per meglio caratterizzare il ruolo di BCAT1 e i possibili meccanismi metabolici associati al suo fenotipo pro-tumorigenico, abbiamo utilizzato dei modelli murini di leucemia indotta da NOTCH1, che portano mutazioni in NOTCH1 frequentemente trovate in pazienti con LAL-T (L1601P- PEST o ΔE-NOTCH1). Abbiamo trovato che l’espressione di Bcat1 è significativamente elevata in cellule leucemiche murine dipendenti NOTCH1 rispetto ai normali timociti. Inoltre, l'inibizione della segnalazione di NOTCH1 con un potente inibitore della gamma secretasi (DBZ) in vivo portava ad una significativa down-regolazione dell'espressione di Bcat1. Infine, attraverso esperimenti di metabolomica abbiamo osservato che, a seguito del trattamento con DBZ, i livelli di leucina, di isoleucina e dei loro derivati metabolici erano significativamente ridotti, suggerendo che l'attività enzimatica di BCAT1 influenzata dall'inibizione di NOTCH1 possa contribuire alla funzione oncogenica di NOTCH1 nella LAL-T. Dati questi risultati, abbiamo generato un modello murino che porta una delezione costitutiva del gene Bcat1 per stabilire se la perdita di Bcat1 potesse ostacolare la leucemia indotta da NOTCH1. La nostra analisi ha dimostrato che l'assenza di Bcat1 non influenzava lo sviluppo delle cellule T ad uno stato basale né ad alterazioni fenotipiche in vari tessuti linfoidi analizzati. Inoltre, i nostri studi preliminari hanno anche dimostrato che la perdita di Bcat1 significativamente estendeva la sopravvivenza in topi leucemici trapiantati con progenitori di cellule T trasdotti con allele oncogenico NOTCH1 rispetto ai progenitori di cellule T normali. In sintesi, i nostri risultati evidenziano un ruolo specifico di BCAT1 nel contesto della LAL-T e suggeriscono fortemente che BCAT1 può essere un nuovo promettente target per i pazienti di LAL-T che presentano mutazioni attivanti l’oncogene NOTCH1.