Il gene Bin1 dà origine a proteine derivanti da splicing alternativo che interagiscono con c-Myc ed hanno un ruolo di soppressori tumorali. Esse inibiscono la trasformazione cellulare Myc-mediata e promuovono l’apoptosi in linee cellulari tumorali. Scopo di questo studio è la valutazione di espressione del trascritto Bin1 in biopsie di rabdomiosarcoma (RMS) rispetto al muscolo scheletrico fetale, di analizzarne l’espressione sia a livello trascrizionale che proteico in linee cellulari di RMS e di esaminare il possibile ruolo di Bin1 nella biologia di questo tumore. Abbiamo valutato il livello di espressione di Bin1 mediante Sybr Green real time PCR in sei biopsie e successivamente in linee cellulari di RMS (RH30, RH4, RH28, RC2, RD, CCA, SMS). In quest’ultime, trascritti contenenti l’esone 10, caratteristico di isoforme muscolo-associate è stata analizzata mediante RT-PCR di una porzione centrale di Bin1. Inoltre mediante RT-PCR, PCR e sequenziamento dopo clonaggio si sono individuati i diversi trascritti in RC2, RH30 e RD. Lo studio dell’espressione proteica di Bin1 è stato effettuato tramite tecniche di Western-blot e immunofluorescenza su preparati citologici. I risultati ottenuti tramite PCR quantitativa hanno confermato la sottoespressione di Bin1sia nelle biopsie che nelle linee cellulari di RMS. L’espressione di trascritti caratterizzati dalla presenza dell’esone 10 è stata rinvenuta in tutte le linee e tramite clonaggio e sequenziamento si è rilevata la presenza di sette diverse isoforme nelle 3 linee cellulari esaminate. Tra queste abbiamo identificato isoforme ubiquitarie e muscolo-associate, che da precedenti lavori sembrano caratterizzate da un’attività anti-tumorale, trascritti derivanti da splicing aberrante e trascritti la cui funzione non è nota. Dati preliminari confermano la presenza delle isoforme proteiche ubiquitarie e muscolo-associate in tutte le 7 linee cellulari. Lo studio in immunofluorescenza di RD, RH30, RH4 dimostra la localizzazione prevalentemente nucleare di Bin1. In base a questi risultati intendiamo procedere alla trasfezione di alcune isoforme in cellule RH30 e RD per valutare il possibile ruolo anti-apoptotico di Bin1, di controllo del ciclo cellulare e/o differenziamento al fine di comprendere le conseguenze della sottoespressione di Bin1 nel RMS

RABDOMIOSARCOMA: ESPRESSIONE E RUOLO DI BIN1

LANFRANCHI, GEROLAMO;ROSOLEN, ANGELO
2006

Abstract

Il gene Bin1 dà origine a proteine derivanti da splicing alternativo che interagiscono con c-Myc ed hanno un ruolo di soppressori tumorali. Esse inibiscono la trasformazione cellulare Myc-mediata e promuovono l’apoptosi in linee cellulari tumorali. Scopo di questo studio è la valutazione di espressione del trascritto Bin1 in biopsie di rabdomiosarcoma (RMS) rispetto al muscolo scheletrico fetale, di analizzarne l’espressione sia a livello trascrizionale che proteico in linee cellulari di RMS e di esaminare il possibile ruolo di Bin1 nella biologia di questo tumore. Abbiamo valutato il livello di espressione di Bin1 mediante Sybr Green real time PCR in sei biopsie e successivamente in linee cellulari di RMS (RH30, RH4, RH28, RC2, RD, CCA, SMS). In quest’ultime, trascritti contenenti l’esone 10, caratteristico di isoforme muscolo-associate è stata analizzata mediante RT-PCR di una porzione centrale di Bin1. Inoltre mediante RT-PCR, PCR e sequenziamento dopo clonaggio si sono individuati i diversi trascritti in RC2, RH30 e RD. Lo studio dell’espressione proteica di Bin1 è stato effettuato tramite tecniche di Western-blot e immunofluorescenza su preparati citologici. I risultati ottenuti tramite PCR quantitativa hanno confermato la sottoespressione di Bin1sia nelle biopsie che nelle linee cellulari di RMS. L’espressione di trascritti caratterizzati dalla presenza dell’esone 10 è stata rinvenuta in tutte le linee e tramite clonaggio e sequenziamento si è rilevata la presenza di sette diverse isoforme nelle 3 linee cellulari esaminate. Tra queste abbiamo identificato isoforme ubiquitarie e muscolo-associate, che da precedenti lavori sembrano caratterizzate da un’attività anti-tumorale, trascritti derivanti da splicing aberrante e trascritti la cui funzione non è nota. Dati preliminari confermano la presenza delle isoforme proteiche ubiquitarie e muscolo-associate in tutte le 7 linee cellulari. Lo studio in immunofluorescenza di RD, RH30, RH4 dimostra la localizzazione prevalentemente nucleare di Bin1. In base a questi risultati intendiamo procedere alla trasfezione di alcune isoforme in cellule RH30 e RD per valutare il possibile ruolo anti-apoptotico di Bin1, di controllo del ciclo cellulare e/o differenziamento al fine di comprendere le conseguenze della sottoespressione di Bin1 nel RMS
2006
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