Microgenomics of skeletal muscle: transcriptional analysis of isolated murine myofibers

Background: The complex anatomy of skeletal muscle and the heterogeneity of myofibers are actually obstacles when gene expression studies are undertaken using whole muscle samples, as it would be important to precisely identify the actual contribution of single myofibers to the muscle transcriptional phenotype. To be really informative on diversity among fiber types, experiments on gene expression should be carried out at the level of single fibers. The goal of the work was to define the phenotype of single muscle myofibers in terms of gene expression. I choose the genomic technology of transcriptome profiling because it allows a wide phenotypic characterization, and because change in gene expression is the most immediate answer of muscle fiber to any physiological stimulus. Materials and methods: I set up experimental procedures aimed to obtain good quality microarray data from isolated myofibers. Fibers were gently dissociated after enzymatic treatment with collagenase from soleus and extensor digitorum longus murine muscles. Each fiber was divided in two fragments: the first was used for myosin heavy chain isoform classification by SDS-PAGE and the second for microarray experiments. Microarray data were confirmed by real-time PCR. Results and discussion: Microgenomic technologies have been successfully applied at the level of single muscle fibers and this represents a technological advancement in the field of muscle physiology. Expression profiles of isolated myofibers are free of non-muscle transcripts. Comparison of fiber types allowed the identification of modules of co-expressed genes (coding for proteins involved in muscle contraction, metabolism, and Ca2+ homeostasis) that define physiological properties of skeletal muscle fibers and would allow a better understanding of the plastic transcriptomic transitions occurring in myofibers under physiological and pathological conditions.

Introduzione: I profili di espressione genica di muscolo risentono della complessa composizione cellulare del muscolo scheletrico e dell’eterogeneità delle stesse miofibre che lo compongono. È necessario riuscire a definire come queste singole unità contrattili contribuiscano al fenotipo trascrizionale del muscolo e dunque, per essere veramente informativi sulla diversità tra i tipi di fibra, gli esperimenti di espressione genica dovrebbero essere condotti a livello delle singole fibre. Questo lavoro si pone come obiettivo la descrizione trascrittomica del fenotipo dei diversi tipi di miofibra. Ho scelto di utilizzare le tecnologie genomiche per studiare il trascrittoma poiché permettono una caratterizzazione fenotipica su larga scala e perché i cambiamenti di espressione genica sono la risposta più immediata delle fibre muscolari ai vari stimoli fisiologici. Materiali e metodi: Ho sviluppato una serie di procedure sperimentali volte a ottenere dati di microarray di buona qualità partendo da miofibre isolate. Le fibre vengono dissociate dopo trattamento enzimatico con collagenasi dai muscoli di topo soleo ed extensor digitorum longus. Ciascuna fibra è stata divisa in due parti: la prima è stata utilizzata per la classificazione dell’isoforma della catena pesante della miosina attraverso SDS-PAGE e la seconda per gli esperimenti di microarray. I risultati ottenuti sono stati confermati tramite PCR quantitativa. Risultati e discussione: Le tecnologie microgenomiche sono state applicate con successo a livello delle singole fibre muscolari e questo rappresenta un’importante innovazione tecnologica nel campo della fisiologia del muscolo. Il confronto tra i vari tipi di fibra ha permesso di individuare moduli di geni co-espressi (codificanti per proteine coinvolte nella contrazione muscolare, nel metabolismo e nell’omeostasi del Ca2+) che definiscono le proprietà fisiologiche delle fibre del muscolo scheletrico e che permetteranno una maggior comprensione dei cambiamenti plastici del trascrittoma in diverse condizioni fisiopatologiche.