Italian cider: a new potentially typical product to be characterized

The objective of this PhD research project has been to evaluate some characteristics (e.g., allergens content, polyphenols profile and antioxidant potential) of the Italian ciders that could affect the human health. In this way we tried to promote the product contributing to improve the knowledge needed to better the production techniques. The first aspect described in this PhD study was the recovery of cider proteins (Chapter 2). The rationale was the knowledge that, in other fermented beverages, these molecules are described to be involved in specific organoleptic characteristics such as foam stability, in the interaction with the aroma compounds in the formation of hazes and sediments. In addition, proteins could elicit allergenic reactions in sensitive individuals. After the setup of the recovery methods, proteins purified from 18 commercial ciders were identified by LC-MS/MS technique. This high sensitive method revealed the presence of Mal d 2 and Mal d 3 proteins in all the cider samples analyzed. In addition, this technique showed that 12 out of 18 ciders are contaminated by hen egg lysozyme that is a well-known allergen, even if its use and presence was not declared on the label as stated by the EU Directive. Since the LC-MS/MS analysis detects only fragments of protein that could not be immunologically active, ELISA and western blot analyses were achieved for the detection of lysozyme. Two samples out of 18 were both positive to the assays applied and this confirm the immunological activity of the protein and the existence of a serious health concern to drink cider for people sensitized to egg (Chapter 3). The following step was to study the effect of cidermaking procedure on apple allergen. For this reason, the immunological activity of Mal d 2 and Mal d 3 proteins was tested with specific antibodies developed in rabbit. Six and four samples out of the 13 ciders considered were positive to Mal d 2 and Mal d 3, respectively. It is important to highlight that not all the samples showed a positive match to both the apple allergens. This could indicate that the technological process in cidermaking could achieve a selective removal of specific allergens. Moreover, as regarding Mal d 3 the antibody detected an ambiguous signal at the level of the stacking gel of almost all samples (Chapter 4). Finally, an aspect related to the wholesomeness of cider was investigated. The polyphenols profiles of 18 Italian ciders were correlated with their antioxidant activity, and a multiple linear regression model was drawn to predict the antioxidant potential of the beverage, knowing the concentration of specific phenols (namely: chlorogenic acid, catechin, procyanidins B1 and B2, quercetins 3-glucoside, 3-xyloside and 3-arabinopyranoside). This suggests that these phenols could be the mainly contributors of the antioxidant activity, but further studies should be performed to exclude that this correlation could be only an epiphenomenon consequence of particular interactions among different molecules. Anyway the total antioxidant activities of Italian ciders results on average lower than those reported in literature for Asturian ones and this could be probably related to the total polyphenols content and their profiles (Chapter 5). This observation suggests that the Italian cidermaking process could be ameliorated taking in consideration both the allergenic profile of the beverage and the preferences of the Italian consumers.

L'obiettivo di questa tesi di dottorato è stato quello di valutare alcune caratteristiche dei sidri Italiani che potrebbero incidere sulla salute umana, come ad esempio, gli allergeni, il contenuto di polifenoli e il potenziale antiossidante, incrementando in questo modo il valore aggiunto della bevanda. In un certo senso, si è cercato di promuovere la commercializzazione del prodotto, contribuendo a migliorare le conoscenze necessarie per ottimizzarne le tecniche di produzione. Il primo aspetto descritto in questo studio è stato la purificazione preparativa delle proteine del sidro (Capitolo 2). La logica di questo approccio è costituita dalla conoscenza che, in altre bevande fermentate, queste molecole sono descritte come coinvolte nel determinare caratteristiche organolettiche specifiche, quali la stabilità della schiuma, l'interazione con i composti aromatici e la formazione di intorbidamenti e di sedimenti. Va inoltre tenuto presente che, le proteine del sidro potrebbero essere coinvolte nello scatenamento di reazioni allergiche in soggetti sensibili. Dopo la messa a punto dei metodi preparativi, le proteine purificate da 18 sidri commerciali sono state identificate con la tecnica LC-MS/MS. Questo metodo ad alta sensibilità ha rivelato la presenza delle proteine Mal d 2 e Mal d 3 in tutti i campioni analizzati. Inoltre, questa tecnica ha dimostrato come 12 sidri su 18 campioni siano contaminati da lisozima di uovo di gallina. Quest’ultima proteina è un noto allergene, anche se la sua presenza non risultava dichiarata in etichetta, come invece sarebbe previsto dalla Direttiva dell'Unione Europea 2007/68/CE. Poiché l'analisi LC-MS/MS rileva solo frammenti di proteina che potrebbero non essere immunologicamente attivi, sono stati eseguiti un test ELISA e l’analisi con la metodica western blot. Due campioni su 18 sono risultati positivi ai test applicati e questo ha confermato l'attività immunologica della proteina e l'esistenza di un serio rischio per la salute delle persone sensibilizzate alle uova, qualora dovessero bere del sidro (Capitolo 3). Il passo successivo è stato quello di studiare l'effetto della procedura di produzione del sidro sugli allergeni della mela. Per questo motivo, l'attività immunologica delle proteine Mal d 2 e Mal d 3 è stata testata con anticorpi (IgG) specifici sviluppati in coniglio. Rispettivamente sei e quattro sidri su 13 campioni sono risultati positivi per Mal d 2 e Mal d 3. È importante sottolineare che non tutti i campioni hanno mostrato un risultato positivo per entrambi questi allergeni di mela. Questo indicherebbe che alcuni passaggi del processo tecnologico di produzione del sidro potrebbero produrre una rimozione selettiva di specifici allergeni. Tuttavia, riguardo alla proteina Mal d 3, il saggio anticorpale in western blot, ha rilevato un segnale ambiguo a livello del gel di impaccamento di quasi tutti i campioni (Capitolo 4). Questo dato dovrà essere oggetto di ulteriori approfondimenti. Infine, è stato studiato un aspetto che è correlato alla salubrità del sidro. I profili polifenolici di 18 sidri Italiani sono stati correlati con la loro attività antiossidante, ed è stato realizzato un modello di regressione lineare multipla al fine di correlare il potenziale antiossidante della bevanda con la concentrazione di polifenoli specifici (in particolare: acido clorogenico, catechina, procianidine B1 e B2, quercetine 3-glucoside, 3-xiloside e 3-arabinopiranoside). I risultati ottenuti potrebbero suggerire che questi polifenoli siano quelli che principalmente contribuiscono all’attività antiossidante della bevanda, ma ulteriori studi dovranno essere eseguiti per escludere che questa correlazione non possa essere solo un epifenomeno dovuto, per esempio, a particolari interazioni di molecole diverse. In ogni caso, l’attività antiossidante dei sidri Italiani è risultata mediamente inferiore a quella riportata in letteratura per i sidri delle Asturie, e questo potrebbe probabilmente essere dovuto al contenuto di polifenoli totali e al loro profilo (Capitolo 5). Tutte queste osservazioni suggeriscono che il sidro, attualmente prodotto in Italia, sia un prodotto che potrebbe essere migliorato sotto il punto di vista salutistico pur tenendo in considerazione le peculiarità organolettiche ricercate dal consumatore locale.