Cellule fibroblastoidi multipotenti da sangue eriferico: una nuova risorsa per la rigenerazione tessutale

In the last decade, the use of multipotent adult stem cells (MSC) has paved way for the identification of new therapeutic approaches for the treatment of acquired structural tissue defects or degenerative diseases. For exploiting the maximum therapeutic potential of these cells, there is an urgent need for clear understanding of the characteristics of multipotent stem cells isolated from animal and human peripheral blood, being an ideal source, characterized by high availability and non-invasive extraction technique. In the present work, a method for the isolation of multipotent cells from human peripheral blood (human Peripheral Blood Cells / hPBC) has been defined. The characterization of the immunophenotypic, proliferative and differentive properties of extracted fibroblast-like populations has highlighted their potential use in tissue engineering applications. The comparison with the cell populations isolated from animal peripheral blood (porcine Peripheral Blood Cells / pPBC) has demonstrated their distinctive immunophenotypic and proliferative properties. In particular, for both cell populations, qPCR analysis showed the expression of genes of pluripotency such as Nanog, SOX2, Klf4 and c-Myc, while the Doubling Time study has highlighted a constant proliferative capacity associated to immunophenotypic stability in the culture expansion. Flow cytometry analysis showed that the animal and human populations originate from different stem cell niches: hPBC, because of the expression of markers such as NG2 and CD13, may arise from the perivascular region, while pPBC, expressing CD44, could mobilize to the peripheral blood from bone marrow. Being responsive to in vitro stimuli and differentiating towards osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineages, pPBC and hPBC can be considered as multipotent stem cells. Growth assays on porcine acellular valvular matrices have shown that pPBC engraft well onto the matrices expressing the specific gene profile of cell populations typically present in aortic and pulmonary heart valves. The immunomodulatory properties of hPBC were investigated by co-culture with human lymphocytes and analysis of qPCR after treatment with the proinflammatory cytokine INFγ; these studies have shown the ability of human populations to regulate the proliferation of lymphocytes, monocytes and granulocytes by the expression of genes involved in inflammatory response, such as CXCL9, IDO1 and COX2.

Nell’ultimo decennio, l’impiego di cellule staminali adulte multipotenti (CSM) ha consentito l’individuazione di nuovi approcci terapeutici per la cura di difetti tessutali strutturali acquisiti o di malattie degenerative. Per la realizzazione dei cosiddetti prodotti di terapia avanzata, l’identificazione di cellule staminali multipotenti circolanti animali ha suscitato un particolare interesse nei confronti del sangue periferico umano quale fonte ideale, caratterizzata da facile reperibilità e da tecnica estrattiva non invasiva. Nel presente lavoro è stata definita una metodica di isolamento di cellule multipotenti da sangue periferico umano (human Peripheral Blood Cells / hPBC). La caratterizzazione delle proprietà immunofenotipiche, proliferative e differenziative delle popolazioni fibroblastoidi estratte ne ha evidenziato la potenzialità di impiego in applicazioni di ingegneria tessutale. Il confronto con le popolazioni cellulari isolate da sangue periferico animale (porcine Peripheral Blood Cells / pPBC) ne ha dimostrato proprietà immunofenotipiche e proliferative distintive. In particolare, per entrambe le popolazioni cellulari, l’analisi di qPCR ha evidenziato l’espressione di geni di pluripotenza quali Nanog, SOX2, Klf4 e c-Myc, mentre lo studio del Doubling Time ne ha messo in luce una capacità proliferativa costante associata ad una stabilità immunofenotipica nella coltura espansiva. L’analisi mediante citofluorimetria ha definito per le popolazioni umane e animali la derivazione da nicchie staminali differenti: infatti le cellule hPBC, esprimendo marcatori quali NG2 e CD13, potrebbero derivare dalla regione perivascolare, mentre le cellule pPBC, esprimendo il CD44, potrebbero mobilitare nel sangue periferico da midollo osseo. Risultando entrambe responsive in vitro a stimoli di tre differenti linee differenziative, le cellule pPBC e hPBC possono considerarsi cellule staminali multipotenti. Studi di crescita su matrici valvolari acellulari porcine hanno dimostrato che le cellule pPBC rispondono agli stimoli del supporto esprimendo il profilo genico specifico delle popolazioni cellulari tipicamente presenti nelle valvole cardiache aortiche e polmonari. Lo studio delle proprietà immunomodulatorie delle cellule hPBC mediante co-coltura con linfociti umani e analisi di qPCR dopo trattamento con la citochina proinfiammatoria INFγ, ne ha evidenziato la capacità di regolare la proliferazione di linfociti, monociti e granulociti mediante l’espressione di geni coinvolti nella risposta infiammatoria, quali CXCL9, IDO1 e COX2.