Setting up of an innovative procedure for redox proteomics: and its application for definition of the redox status of cells with high metastatic potential

BACKGROUND: The cysteine (Cys) proteome includes 214.000 Cys with thiol and other forms. Of these, only a relatively small subset functions in cell signalling. Redox-active Cys are more susceptible to oxidation, and their oxidized form is more susceptible to reduction. Specific proteomic techniques are required to identify these modifications and to study their regulation in different cell processes that are collectively known as redox proteomics. Thus, it is of interest to be able to identify both the proteins and the cysteine residues affected, and to quantify the extent of the modification involved.The quantification of differences between two or more physiological states of a biological system is among the most challenging technical tasks in proteomics: liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) based quantification methods have gained increasing robustness and reliability over the past five years. Many authors still share a view of redox signalling in which the fate of the cell is dependent mainly on the intensity and duration of pro-oxidant stimulus: here we sustain the involvement of an equilibrium encompassing the action of both nucleophiles and electrophiles at the same time. AIM: The dual aim of my PhD work has been both to develop suitable methodology to identify and quantify redox-active proteins in complex samples and to apply it to the study of a cellular model of breast cancer (MCF10A) engineered to reproduce malignancy. METHODS: In order to pursue this aim, I took advantage of an approach integrating differential chemical sample labelling (non-isotopic) with Cys reactive probes (NEM, IAM, HPDP) and chromatographic purification of redox-sensitive proteins, with subsequent LC-MS/MS analysis and computational data handling for OpenMS-based label-free quantification. All the steps of this methodology have been developed and validated in close collaboration with experts from both the biochemistry and bioinformatics field. RESULTS: We obtained an efficient cost-effective and isotopes-free methodology to characterize the redoxome in complex protein samples. Application of our quantification protocol to benchmark dataset leads to 100% correct estimates of under/over expression of the protein moiety. Application of the methodology to the breast cancer cellular model lead to identification of more than 300 proteins and allowed us to group-up unchanged and differentially oxidized redox-sensitive proteins in the more malignant cells in respect to their less aggressive counterpart. CONCLUSION: Despite the commonly accepted association between cancer and higher oxidative-stress, this study links higher breast cancer cells malignancy to a finely tuned dynamic equilibrium in which selected protein targets are oxidized in the context of a more reduced cell environment. Preliminary results point at the enzyme G6PDH as a crucial regulator of this redox process.

STATO DELL’ARTE: Il proteoma include 214.000 cisteine in forma di gruppi tiolici liberi od altra forma. Di queste, solamente un insieme relativamente ristretto ha un ruolo nella mediazione di segnali cellulari. Tali cisteine, attive dal punto di vista dell’ossido-riduzione, sono più sensibili all’ossidazione e la loro forma ossidata è più facilmente riducibile. Sono dunque necessarie specifiche tecniche di proteomica, globalmente indicate con il termine proteomica delle ossido-riduzioni, per identificare tali modifiche e studiarne la regolazione in diversi processi cellulari. Risulta quindi determinante la capacità di identificare sia le proteine che i residui coinvolti e di quantificarne il grado di modificazione. E proprio la quantificazione delle differenze tra due o più stati di un sistema biologico, si colloca tra gli obiettivi tecnicamente più sfidanti della proteomica: nel corso degli ultimi cinque anni, tecniche basate sulla spettrometria di massa associata a cromatografia in fase liquida hanno progressivamente guadagnato affidabilità e robustezza. Molti autori condividono tuttora una visione delle ossido-riduzioni nella mediazione del segnale in cui il destino cellulare dipende principalmente dall’intensità e dalla durata degli stimoli ossidanti: nel presente lavoro si vuole invece sostenere il coinvolgimento di un equilibrio che includa l’azione concomitante sia di specie nucleofile sia di specie elettrofile. OBIETTIVO: Il duplice obiettivo del mio lavoro di Dottorato è stato sia lo sviluppo di una metodologia idonea all’identificazione e quantificazione di proteine, attive dal punto di vista delle ossido-riduzioni, in campioni complessi, sia l’applicazione di tale metodologia allo studio di un sistema cellulare ingegnerizzato di carcinoma mammario (MCF10A) caratterizzato da diversi gradi di malignità. METODI: Al fine di perseguire tale obiettivo ho tratto vantaggio da un approccio che integra la marcatura chimica differenziale (non-isotopica) per mezzo di sonde reattive con i residui di cisteina (NEM, IAM, HPDP) e la purificazione cromatografica delle proteine attive dal punto di vista ossido-riduttivo, alla successiva analisi LC-MS/MS ed elaborazione informatizzata dei dati mediante OpenMS per una quantificazione label-free. Tutti i passaggi di tale metodologia sono quindi stati messi a punto e validati in stretta collaborazione con esperti biochimici e bioinformatici. RISULTATI: E’ stato sviluppato un metodo efficiente ed economico, non basato sull’utilizzo di marcatori isotopici, per la caratterizzazione delle proteine attive dal punto di vista ossido-riduttivo in campioni proteici complessi. L’applicazione del protocollo di quantificazione ad un campione test ha dato il 100% di stime corrette di sovra/sotto-espressione della miscela proteica. L’applicazione del metodo allo studio del modello cellulare di carcinoma mammario ha portato all’identificazione di più di 300 proteine ed ha permesso il raggruppamento di quelle sensibili dal punto di vista ossido-riduttivo in gruppi non differenziali e sovra- o sotto-ossidate nelle cellule più maligne rispetto alla loro controparte meno aggressiva. CONCLUSIONI: Nonostante sia comunemente riconosciuta l’associazione tra fenomeni neoplastici ed uno stress ossidativo, questo studio collega la maggiore malignità di un modello cellulare di carcinoma mammario ad un complesso equilibrio ossido-riduttivo. In questo contesto, specifici bersagli proteici sono ossidati mentre viene mantenuto un ambiente cellulare complessivamente ridotto. Risultati preliminari evidenziano poi l’enzima G6PDH come possibile elemento chiave nella regolazione di tale equilibrio.