La mutazione S59P del gene TNFRSF1A, associata alla TRAPS, causa l'attivazione costitutiva della via del segnale NFkB

Background. The TNF receptor associated periodic syndrome (TRAPS) is an autosomal dominant autoinflammatory disease due to mutations within the TNFRSF1A gene that codify the TNF receptor 1. Clinically TRAPS patients have recurrent fever associated to myalgia, gastrointestinal symptomps, arthritis or arthralgia, pericarditits and conjuntival pains .The study of the pathophysiology of TRAPS has been fundamental to understand the mechanism of action of TNFR1. Different mutations in the gene result in different aberrant functions of the protein that involve modification in the shedding or in protein folding or in intracellular signalling of TNFR1 . To date up to 100 mutations are found associated to the development of TRAPS. The majority of the mutation are located within Cisteinic Rich Domains (CRDs). They have a high penetrance as T50M and the phenotype is a typical TRAPS. There are other mutations that not involve the CRDs. they have a low penetrance and are ssociated with a variable phenotype as R92Q. Recently in our laboratory It was identify a novel mutation in TNFRSF1A gene that resulting in Pro for Ser aminoacid substitution at residue 59 of the mature protein (S59P) in adult TRAPS patient. Aims. The aim of this work is to study the effects of this mutation on signalling pathway of TNFR1 and compare the results with whose obtained from high penetrance T50M and low penetrance R92Q mutation that are described in literature. Methods. Human Embryonic Kidney (HEK293) cell line was stably transfected with a construct cointaning Wild-Type(WT) TNFRSF1A gene and c.262T>C (S59P), c.362G>A (R92Q) c.236C>T(T50M) TNFRSF1A mutants. The new four cell lines obtained were stimulated with TNFa(60ng/mL) to evaluate the cellular location of the TNFR1. The cell were stimulated with TNFa (60ng/mL) at different intervals to evaluate the IkBa phosphorilation. The downstream targets of NF-kB signalling (IL8) were measured in the supernatants (ELISAs) of all cell lines after they have been kept in culture medium alone (negative control) or stimulated for 4 hours with different concentration of TNFa(60-6-0.6 ng/mL). Finally we choose the TNFa concentration of 6ng/mL to evaluate the NFkB signalling by western blot in the cells. Since the S59P patient is actually in therapy with anti-IL1R, we used IL1b (1ng/mL) as a stimulus to evaluate the NFkB signalling. To compare the in vitro results, the same conditions were performed in PBMC from patients affected TRAPS with S59P and R92Q mutation and from healthy subjects. Results. At confocal mycroscopy. TNFa caused a membranal shift of TNFR1 in WT, while it induced its cytoplasmatic accumulation in mutants. pIkB-a was reduced by TNFa and IL1b in WT, while in mutant we observed a significantly increase of phosphorilation of this protein. This was confirmed by activation and translocation of p65 unit, witch was not observed in WT cells but marked induced in mutant cells, mainly by TNFa but also by IL1b TNFa dose-dependently induced IL8 release, being the magnitude of increase significanlty higher in mutant cells with respect to WT cells. Patients data confirmed in vitro results. The phosphorilation of IkBa was constitutively increased in mutant PBMC respect to W/W. TNFa and IL1b intensify the phosphorilation. In mutant PBMC NFkB activation was maintained after TNFa stimulus. IL1b sustained the activation only in S59P PBMC. LPS induced a significant release of IL1b, IL6, IL8 and TNFa in all PBMC. In S59P PBMC mainly IL1b induce a significant and persistent enhancement of IL6 and IL8. Conclusions. The novel S59P mutation, in TNFRSF1A gene cause a TNFRI receptor defective in cellular trafficking and insensitive to ligand. The mutant receptor activated appears to induce a significant a persistent NFkB activation and cytokine release. In S59P TRAPS patient the NFkB pathway was basely activated despite treatment with anti-IL1. This TNFR mutation appear to sensitize cells to IL1b effects

Introduzione. La sindrome associata al recettore del TNF (TRAPS) è una malattia genetica a trasmissione autosomica dominante a penetranza incompleta, dovuta a mutazioni del gene TNFRSF1A che codifica per iI recettore tipo I del TNF (TNFR1). Dal punto di vista clinico i pazienti presentano diversi sintomi quali febbre ricorrente associata a mialgia, sintomi gastrointestinali, artriti, pericarditi e congiuntiviti. I meccanismi cellulari che caratterizzano la patofisiologia della TRAPS sono di fondamentale importanza per comprendere il meccanismo di azione del recettore del TNF. Le diverse mutazioni presenti nel gene determinano differenti comportamenti della proteina modifcata che possono coinvolgere la diffusione, il folding proteico o il signalling intracellulare del recettore attivato. La maggior parte delle mutazioni sono localizzate nel dominio extracellulare (CRD) della proteina, coinvolto nel legame con il TNFa. Le mutazioni più drastiche coinvolgono i residui cisteinici ma e sistono anche mutazioni ad alta penetranza che non coinvolgono questi residui, come la mutazione T50M, che determinano un quadro clinico fenotipico severo e mutazioni a bassa penetranza con quadro fenotipico più variabile come la mutazione R92Q. Di recente è stata identificata una nuova mutazione della regione codificante, c.262T>C (S59P), in un paziente adulto affetto da TRAPS che determina la sostituzione aminoacidica della serina (S) i prolina (P) in posizione 59 della proteina matura. Scopi. Lo scopo del presente lavoro è stato studiare gli effetti di questa mutazione sulla via del segnale intracellulare del TNFR1 e confrontare i risultati con quelli ottenuti dalle mutazioni T50M e R92Q già note in letteratura. Metodi: è stato creato un vettore contenente il cDNA Wild Type (WT) e tre vettori con le rispettive mutazioni c.262T>C (S59P), c.362G>A (R92Q) c.236C>T(T50M) mediante reazione di mutagenesi sito-diretta. I vettori sono stati inseriti nella linea cellulare Human Embryonic Kidney (HEK293) mediante trasfezione stabile e sono state ottenute quattro nuove linee cellulari HEK WT, HEK S59P, HEK R92Q e HEK T50M. Le cellule ottenute sono state stimolate con TNFa (60ng/mL) al fine di osservare la localizzazione cellulare del recettore mediante immunofluorescenza indiretta e per valutare la fosforilazione di IkBa nel tempo mediante analisi al western blot. Le cellule sono state stimolate per 4 ore in assenza o con TNFa a diverse concentrazioni (0.6,6,60 ng/mL) per valutare il rilascio di prodotti dell'attivazione del segnale NFkB mediante analisi immunoenzimatica (ELISA). Sulla base dei risultati preliminari ottenuti abbiamo scelto di utilizzare la concentrazione intermedia di TNFa a 6ng/mL per valutare il signalling NFkB nelle cellule considerate. Dal momento che il paziente con la mutazione S59P è attualmente in terapia con anti-IL1, abbiamo utilizzato anche lo stimolo con IL1b (1ng/mL) nei modelli sperimentali. Per confrontare i risultati ottenuti con il modello in vitro, abbiamo eseguito le medesime condizioni sperimentali nei PBMC isolati dal sangue periferico del paziente affetto da TRAPS con la mutazione S59P, da un paziente con la mutazione R92Q e da cinque soggetti sani privi di mutazione nel gene del recettore del TNF (W/W). Risultati. Dall'analisi di immunofluorescanza è stato osservato che il TNFa induce un regolare 'trafficking' del TNFR nelle cellule WT, mentre la pesenza delle mutazioni determinano un accumulo, in forma di aggregati citoplasmatici, del recettore del TNF, all'interno delle cellule. Il TNFa e IL1b riducevano la fosforilazione di IkBa nelle cellule WT, mentre nelle cellule mutate si osservava un significativo incremento della fosforilazione di questa proteina. L'attivazione e traslocazione di NFkB si correla con quanto osservato. Nelle cellule WT gli stimoli infiammatori riducevano l'attivazione della subunità p65 di NFkB, mentre nelle cellule mutate l'attivazione era marcatamente indotta, principalmente da TNFa ma anche da IL1b. Lo stimolo con TNFa induceva un rilascio di IL8 significativamente più elevato nelle cellule mutate rispetto alle cellule WT. I risultati ottenuti dagli sperimenti con i PBMC dei pazienti e dei soggetti sani confermavano quanto osservato con il modello in vitro. La fosforilazione era costitutivamente aumentata nei PBMC mutati rispetto ai PBMC W/W e gli stimoli infiammatori intensificavano la fosforilazione. Lo stimolo con TNFa manteneva l'attivazione di NFkB nei PBMC mutati, inoltre nei PBMC S59P, lo stimolo con IL1b faceva persistere l'attivazione. LPS induceva un significativo rilascio di IL1b, IL6, IL8 e TNFa in tutti I PBMC considerati, indipendentemente dalla mutazione. Nei PBMC del paziente con la mutazione S59P IL1b induceva un significativo e persistente rilascio di IL6 e IL8. Conclusioni. La nuova mutazione S59P nel gene del recettore del TNF determina una proteina con una struttura conformazionale modificata da impedire la corretta distribuzione nella cellula e risulta essere attiva anche in assenza di legame con il TNFa. La presenza di questa mutazione determina l'attivazione della via infiammatoria in maniera particolarmente accentuata e persistente. Un contesto iperinfiammatorio osservato in vitro è stato confermato anche nel paziente con la mutazione S59P nonostante sia in terapia antiinfiammatoria. Questa mutazione inoltre sembra rendere le cellule particolarmente sensibili agli effetti dell'IL1b sia per l'attivazione del pathway NFkB sia per il rilascio delle citochine pro infiammatorie