Stem cell therapy is gaining momentum as an effective treatment strategy for degenerative diseases. As embryonic stem cells pose a lot of ethical issues, adult stem cells, isolated from various sources like cord blood, bone marrow or adipose tissue, are being considered as a realistic option due to their well documented therapeutic potentials. In our lab, we have standardised a method to isolate fibroblastic multipotent stem cells (PBMCs) from human peripheral blood, that are able to sustain long term in vitro culture and differentiate towards adipogenic, chondrogenic and osteogenic lineage. In this work, PBMCs were stimulated to obtain in vitro neuronal and myogenic-like cells. Moreover, their restorative potential in degenerative diseases of skeletal muscle and nervous tissue was evaluated using in vivo models. In order to test the neuronal differentiation potential, the cells were seeded (1x104) on gelatin coated dishes and cultured for 7 days in neurobasal medium with EGF and FGF followed by Retinoic acid and NGF for next 7 days. Myogenic induction was carried out using IGF and ascorbic acid for 14 days. At different time points, morphological studies were performed by SEM and specific neuronal and myogenic marker expression were evaluated using RT-PCR, flow cytometry and western blot. PBMCs showed characteristic dendrite like morphology and expressed specific neuronal markers both at mRNA and protein level. The calcium flux activity of PBMCs under stimulation with KCl 56 mM and the secretion of the neurotransmitter, noradrenalin, a precursor in the dopamine synthesis confirmed their ability to acquire a functional phenotype. When premarked by a cell tracker Qdot 800 and injected stearotactically into a rat brain, PBMCs showed to be migratory and proliferative as detected after 10 and 20 days of injection. No tumor mass was identified. The myogenic potential of PBMCs were confirmed by their ability to form syncitium like structures in in vitro culture and to express typical myogenic markers both at early and late phases of differentiation. PBMCs were showed to integrate within the host tissue and to take part in tissue repair as demonstrated in a bupivacaine induced muscle damage model.

Il trapianto di cellule staminali è una strategia terapeutica che sta conoscendo uno sviluppo sempre maggiore come possibile approccio clinico per il trattamento delle malattie degenerative. Considerando i problemi di carattere etico sollevati dall’impiego delle cellule staminali embrionali, le cellule staminali adulte isolate da varie fonti (sangue cordonale, midollo osseo, tessuto adiposo﴿ rappresentano una realistica alternativa, in virtù della loro potenzialità rigenerativa ben documentata. Nel nostro laboratorio è stato standardizzato un metodo per isolare cellule staminali fibroblastoidi multipotenti (Peripheral Blood Multipotent Cells, PBMC) da sangue periferico umano, che possono essere espanse in vitro durante la coltura a lungo termine e sono in grado di differenziare in senso adipogenico, condrogenico e osteogenico. Nel lavoro di tesi del Dott. Senthilkumar Rajendran, le cellule PBMC sono state stimolate per l’ottenimento in vitro di cellule simil-neuronali e -muscolari. Inoltre è stato valutato il loro potenziale rigenerativo nel trattamento di malattie degenerative del muscolo scheletrico e del tessuto nervoso attraverso la sperimentazione in vivo su modelli animali. Al fine di testare il potenziale di differenziazione neuronale, le cellule sono state seminate (1x104) su coating di gelatina e coltivate per i primi 7 giorni in Neurobasal medium addizionato con EGF e FGF, e per i 7 giorni successivi in terreno basale contenente acido retinoico e NGF. L’induzione miogenica è stata effettuata utilizzando IGF e acido ascorbico per 14 giorni. Ad ogni time point, sono stati realizzati studi morfologici mediante SEM e analisi di espressione di specifici marcatori neuronali e miogenici mediante RT-PCR, citofluorimetria e western blot. Le cellule PBMC hanno mostrato una caratteristica morfologia simil-dendritica e l’espressione di specifici marcatori neuronali a livello sia di mRNA che di proteine. Lo studio del flusso del calcio dopo stimolazione con KCl 56 mM e l’attività di secrezione del neurotrasmettitore noradrenalina, precursore nella sintesi della dopamina, hanno confermato la capacità delle cellule PBMC di acquisire un fenotipo funzionale. Dopo marcatura con il tracker cellulare Qdot 800 e iniezione per stereotassi in un cervello di ratto, le PBMC hanno dimostrato un elevato potenziale migratorio e proliferativo dopo 10 e 20 giorni dall'impianto. Non è stata identificata alcuna massa tumorale. Il potenziale miogenico delle popolazioni isolate è stato confermato dalla loro capacità di formare strutture simil-sinciziali durante la coltura in vitro e di esprimere marcatori tipici della linea miogenica, sia a tempi precoci che nelle fasi tardive del differenziamento. Infine, testate in un modello animale di danno muscolare indotto con bupivacaina, le cellule PBMC sono state in grado di integrarsi all'interno del tessuto ospite e di prendere parte nella riparazione dei tessuti.

STUDIES ON LINEAGE SHIFT RESPONSES OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD MULTIPOTENT CELLS / Rajendran, Senthilkumar. - (2014 Jan 30).

STUDIES ON LINEAGE SHIFT RESPONSES OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD MULTIPOTENT CELLS

Rajendran, senthilkumar
2014

Abstract

Il trapianto di cellule staminali è una strategia terapeutica che sta conoscendo uno sviluppo sempre maggiore come possibile approccio clinico per il trattamento delle malattie degenerative. Considerando i problemi di carattere etico sollevati dall’impiego delle cellule staminali embrionali, le cellule staminali adulte isolate da varie fonti (sangue cordonale, midollo osseo, tessuto adiposo﴿ rappresentano una realistica alternativa, in virtù della loro potenzialità rigenerativa ben documentata. Nel nostro laboratorio è stato standardizzato un metodo per isolare cellule staminali fibroblastoidi multipotenti (Peripheral Blood Multipotent Cells, PBMC) da sangue periferico umano, che possono essere espanse in vitro durante la coltura a lungo termine e sono in grado di differenziare in senso adipogenico, condrogenico e osteogenico. Nel lavoro di tesi del Dott. Senthilkumar Rajendran, le cellule PBMC sono state stimolate per l’ottenimento in vitro di cellule simil-neuronali e -muscolari. Inoltre è stato valutato il loro potenziale rigenerativo nel trattamento di malattie degenerative del muscolo scheletrico e del tessuto nervoso attraverso la sperimentazione in vivo su modelli animali. Al fine di testare il potenziale di differenziazione neuronale, le cellule sono state seminate (1x104) su coating di gelatina e coltivate per i primi 7 giorni in Neurobasal medium addizionato con EGF e FGF, e per i 7 giorni successivi in terreno basale contenente acido retinoico e NGF. L’induzione miogenica è stata effettuata utilizzando IGF e acido ascorbico per 14 giorni. Ad ogni time point, sono stati realizzati studi morfologici mediante SEM e analisi di espressione di specifici marcatori neuronali e miogenici mediante RT-PCR, citofluorimetria e western blot. Le cellule PBMC hanno mostrato una caratteristica morfologia simil-dendritica e l’espressione di specifici marcatori neuronali a livello sia di mRNA che di proteine. Lo studio del flusso del calcio dopo stimolazione con KCl 56 mM e l’attività di secrezione del neurotrasmettitore noradrenalina, precursore nella sintesi della dopamina, hanno confermato la capacità delle cellule PBMC di acquisire un fenotipo funzionale. Dopo marcatura con il tracker cellulare Qdot 800 e iniezione per stereotassi in un cervello di ratto, le PBMC hanno dimostrato un elevato potenziale migratorio e proliferativo dopo 10 e 20 giorni dall'impianto. Non è stata identificata alcuna massa tumorale. Il potenziale miogenico delle popolazioni isolate è stato confermato dalla loro capacità di formare strutture simil-sinciziali durante la coltura in vitro e di esprimere marcatori tipici della linea miogenica, sia a tempi precoci che nelle fasi tardive del differenziamento. Infine, testate in un modello animale di danno muscolare indotto con bupivacaina, le cellule PBMC sono state in grado di integrarsi all'interno del tessuto ospite e di prendere parte nella riparazione dei tessuti.
30-gen-2014
Stem cell therapy is gaining momentum as an effective treatment strategy for degenerative diseases. As embryonic stem cells pose a lot of ethical issues, adult stem cells, isolated from various sources like cord blood, bone marrow or adipose tissue, are being considered as a realistic option due to their well documented therapeutic potentials. In our lab, we have standardised a method to isolate fibroblastic multipotent stem cells (PBMCs) from human peripheral blood, that are able to sustain long term in vitro culture and differentiate towards adipogenic, chondrogenic and osteogenic lineage. In this work, PBMCs were stimulated to obtain in vitro neuronal and myogenic-like cells. Moreover, their restorative potential in degenerative diseases of skeletal muscle and nervous tissue was evaluated using in vivo models. In order to test the neuronal differentiation potential, the cells were seeded (1x104) on gelatin coated dishes and cultured for 7 days in neurobasal medium with EGF and FGF followed by Retinoic acid and NGF for next 7 days. Myogenic induction was carried out using IGF and ascorbic acid for 14 days. At different time points, morphological studies were performed by SEM and specific neuronal and myogenic marker expression were evaluated using RT-PCR, flow cytometry and western blot. PBMCs showed characteristic dendrite like morphology and expressed specific neuronal markers both at mRNA and protein level. The calcium flux activity of PBMCs under stimulation with KCl 56 mM and the secretion of the neurotransmitter, noradrenalin, a precursor in the dopamine synthesis confirmed their ability to acquire a functional phenotype. When premarked by a cell tracker Qdot 800 and injected stearotactically into a rat brain, PBMCs showed to be migratory and proliferative as detected after 10 and 20 days of injection. No tumor mass was identified. The myogenic potential of PBMCs were confirmed by their ability to form syncitium like structures in in vitro culture and to express typical myogenic markers both at early and late phases of differentiation. PBMCs were showed to integrate within the host tissue and to take part in tissue repair as demonstrated in a bupivacaine induced muscle damage model.
stem cells, cell therapy, lineage shift, degenerative diseases,
STUDIES ON LINEAGE SHIFT RESPONSES OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD MULTIPOTENT CELLS / Rajendran, Senthilkumar. - (2014 Jan 30).
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
Rajendran_Senthilkumar_tesi.pdf

accesso aperto

Tipologia: Tesi di dottorato
Licenza: Non specificato
Dimensione 3.26 MB
Formato Adobe PDF
3.26 MB Adobe PDF Visualizza/Apri
Pubblicazioni consigliate

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11577/3423582
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact