The role of small non-coding RNAs in human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) infection and transformation

Human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) is the causative agent of two distinct pathologies, adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL), an aggressive neoplasm of mature CD4+ T-cells, and tropical spastic paraparesis/HTLV-1-associated myelopathy (TSP/HAM), a demyelinating neurodegenerative disease. The emerging importance of small noncoding RNAs in normal cell physiology and disease has prompted studies of their role in T-cell activation and transformation. The work described in the present thesis was aimed at understanding the role of small noncoding RNAs, in particular microRNAs and tRNA fragments (tRFs), in HTLV-1 infection and ATLL pathogenesis. The laboratory generated small RNA libraries to identify the repertoire of small noncoding RNAs expressed in two HTLV-1-infected T-cell lines (C91PL and MT-2) compared to normal CD4+ T-cells. Results revealed upregulation of miR-34a in the cell lines. Many tRFs were identified in both uninfected and infected cells. One of the most abundant tRFs (tRF-3019) was derived from the 3’ end of tRNA-proline, which is considered to be the primer for HTLV-1 reverse transcriptase. Results of an in vitro reverse transcriptase assay verified that tRF-3019 was capable of priming HTLV-1 reverse transcriptase. Both tRNA-proline and tRF-3019 were detected in HTLV-1 virus particles. tRF-3019 may thus play an important role in HTLV-1 reverse transcription and could represent a target to control HTLV-1 infection. Data from a microarray-based analysis of microRNA expression in ATLL samples compared to normal CD4+ T-cells revealed 21 downregulated microRNAs and 6 upregulated microRNAs. Upregulated microRNAs included miR-34a, which is a member of the highly conserved miR-34 family that acts as a tumor suppressor induced by p53 in other cell types. However, p53 is known to be functionally inactivated or mutated in ATLL cells and HTLV-1-infected cell lines. Treatment of infected cell lines with nutlin-3a, a drug that restores p53 activity by interfering with MDM2, resulted in an upregulation of miR-34a and strong downregulation of several of its predicted targets. These findings indicate that unblocking the p53 pathway in HTLV-1-infected cells promotes engagement of the miR-34a/mRNA regulatory network. The final aim of the project was to identify microRNAs regulated by the viral regulatory protein Tax. To this end the HTLV-1-negative T-cell line Jurkat was transfected with a Tax expression plasmid and assayed for changes in mRNA and microRNA expression by quantitative RT-PCR. Results revealed significant alterations in the levels of 7 microRNAs in the presence of Tax. These included let-7g, whose levels were reduced in the Tax-expressing cells. Let-7g was also found to be downregulated in ATLL samples compared to normal CD4 cells analysed by microarrays, suggesting that this microRNA might play a tumor suppressor role in HTLV-1-mediated transformation. Experiments are currently underway to identify targets of let-7g in infected cells using as a starting point 14 genes identified by integrating results from microRNA target prediction programs with expression profiles for microRNAs and mRNAs in ATLL cells vs. CD4 controls.

Il virus T-linfotropico umano di tipo 1 (HTLV-1) è l’agente eziologico della leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto (ATLL, Adult T-cell leukemia/lymphoma), un’aggressiva neoplasia a carico dei linfociti T CD4+ maturi, e della paraparesi spastica tropicale/mielopatia associata ad HTLV (TSP/HAM, Tropical spastic paraparesis/HTLV-associated myelopathy), una patologia degenerativa del sistema nervoso centrale. L’interesse crescente nello studio e nella comprensione della funzione degli “small non-coding RNA” in cellule normali e tumorali ci ha spinto ad uno studio del loro ruolo nell’ attivazione e nella trasformazione delle cellule T. Il lavoro descritto nella presente tesi mira a comprendere il ruolo degli “small non-coding RNA” (sncRNA), in particolare microRNA e frammenti tRNA (tRFs), nell’ infezione da HTLV-1 e nella patogenesi dell’ATLL. Nel nostro laboratorio sono state generate librerie di “small RNA” per identificare il repertorio di sncRNA espressi in due linee cellulari infettate con HTLV-1 (C91PL e MT-2) rispetto alle cellule T CD4 + normali. I risultati hanno rivelato un’aumentata espressione del miR-34a nelle linee cellulari infettate. Molti frammenti di tRNA (tRFs) sono stati identificati sia nelle cellule infettate che non infettate. Uno dei tRFs più abbondanti (tRF-3019) è derivato dall’ estremità 3’ del tRNA-prolina, che è considerato il primer per la trascrittasi inversa dell’HTLV-1. I risultati ottenuti da un saggio di trascrittasi inversa in vitro hanno dimostrato che il tRF-3019 è in grado di funzionare da primer nella trascrizione inversa di HTLV-1. La presenza sia del tRNA-prolina che del tRF-3019 è stata evidenziata nelle particelle virali. Il tRF-3019 potrebbe quindi svolgere un ruolo importante nella retrotrascrizione del virus e potrebbe rappresentare un “target” terapeutico nell’infezione da HTLV-1. I dati ottenuti dall’ analisi con microarray sull’ espressione di microRNA in campioni di ATLL e in campioni di cellule T-CD4 + normali ha rivelato una diminuzione nell’espressione di 21 microRNA e un’aumentata espressione di 6 microRNA. I microRNA sovraespressi comprendono anche il miR-34a, che è un membro della famiglia dei miR-34, altamente conservati, che agiscono come oncosoppressori indotti da p53 in diversi tipi cellulari. Tuttavia, p53 è inattiva o mutata in cellule ATLL e in linee cellulari HTLV-1-infettate. Il trattamento di linee cellulari infettate con Nutlin-3a, un farmaco che ripristina l'attività di p53 legandosi a MDM2, ha rivelato un aumeto di espressione di miR-34a e una forte riduzione dell’espressione di alcuni dei suoi target. Questi risultati suggeriscono che attivando il pathway di p53 in cellule HTLV-1-infettate si potrebbe promuovere l’ingaggio del network regolatorio del miR-34a. Infine, ci siamo proposti di identificare i microRNA regolati dalla proteina virale Tax. A tal fine la linea cellulare T non infetta, Jurkat, è stata transfettata con un plasmide di espressione per Tax e sono state testate le variazioni di espressione di mRNA e microRNA mediante RT-PCR. I risultati hanno rivelato che in presenza di Tax ci sono alterazioni significative nei livelli di espressione di 7 microRNA. Queste variazioni includono il microRNA let-7g, i cui livelli sono ridotti nelle cellule che esprimono Tax. Da studi effettuati su microrrays, let-7g risulta sottoespresso in campioni ATLL rispetto alle cellule CD4 normali, suggerendo che questo microRNA potrebbe svolgere un ruolo di oncosoppressore nella trasformazione mediata da HTLV-1. Gli esperimenti, attualmente in corso, permetteranno di identificare i target di let-7g in cellule infettate utilizzando come punto di partenza 14 geni ottenuti dall’integrazione dei risultati dei programmi di predizione dei target dei microRNA con i profili di espressione di microRNA e mRNA in cellule ATLL rispetto ai controlli CD4.