Human red blood cells alterations in Primary Aldosteronism: Mineralocorticoid Receptor (MR) involvement in the Aldosterone pathway

Red blood cells (RBCs) are a-nucleated cells particularly exposed to different stimuli, among which circulating hormones and intra/extra-cellular derivatives from oxidization processes. In addition, our previous studies showed that in the case of inflammatory diseases with GSH content alterations, RBCs were much more sensitive to diamide, a mild oxidant able to trigger tyrosine-phosphorylation (Tyr-P) of membrane proteins, mainly band 3. Aldosterone (Aldo), mineralocorticoid hormone, has been shown to induce many effects other than the common diuretic process regulation and involving the expression and activation of the superoxide generating enzyme NADPH oxidase, thus potentially explaining the increased plasma markers of oxidative stress (OS) like isoprostanes in primary aldosteronism (PA), disease characterized by excessive Aldo secretion. This well-known Aldo action is mediated by the activation of a cytosolic specific receptor, the mineralocorticoid receptor (MR), in the so called genomic pathway, which distinguishes from the direct effect of Aldo on many proteins and enzymes in the second mechanism, also known as non-genomic pathway. Starting from these evidences, if a direct Aldo involvement in the triggering of inflammatory-related oxidative status of the cells was evolving, RBCs were the eligible cells for the investigation of the non-genomic Aldo pathway. The study involved PA patients and healthy control (HC) and consisted with three phases: i) a first approach was carried out to evidence potential alterations in PA RBCs followed by an in vitro deepening to assess the effective direct/indirect involvement of Aldo in these alterations; ii) once identified as responsible of the RBCs alterations found in PA, Aldo pathway within HC RBCs cytosol was investigated; iii) at last, Aldo-related pathway in RBCs was studied with particular attention to the mechanism leading to membrane band 3 alterations starting from Aldo induced receptor activation. In the first part, PA RBCs were showed to have oxidative-like alterations such as band 3 protein increase of both Tyr-P level and clustering, thus suggesting that PA could be linked to other inflammatory diseases. The effects of Aldo, cortisol (Cort) and canrenone (Can) (added as agonist and inhibitor, respectively) were compared and Aldo was confirmed as the only responsible of the alterations previously observed in PA RBCs. Furthermore, Aldo was shown to trigger RBCs membrane alterations leading to autologous IgG binding in a sort of premature ageing of the cells. The second part of the study analyzed the mechanism of Aldo action: for the first time MR was identified in RBCs cytosol as a soluble multi-protein complex, differently regulated by the effector utilized. In facts, in the presence of Aldo, MR broke away from the complex to form dimers which were promptly proteolysed in a sort of turn off signaling. Can or Cort were not able to trigger similar events, thus explaining the different alterations found on RBCs membranes. However, since to now no direct evidence was found about the possibility that Aldo induced an increase of oxidation status in RBCs, oxidization level in both membranes and cytosol was addressed in the third and last part of the study. Results showed no difference in GSH and GSSP contents and carbonic anhydrase (CA) monomerization and activity between HC and PA RBCs. In contrast, preliminary data would confirm a sort of oxidative-related increase of band 3 disulfide bond formation, thus suggesting a new intriguing mechanism leading to band 3 increased oxidative status without changing the common anti-oxidative cellular defenses. Further investigations addressing this mechanism are in progress. In conclusion, we found that in PA RBCs Aldo is responsible for the membrane alterations leading to a potential premature removal of the cells from circulation. Aldo exerts its effect through the activation of the soluble MR complex, which participates in the modulation of the Aldo signaling through the possibility of being differently affected by other steroids or Aldo inhibitors (Can). Further studies are in progress to explore both nature and potential mediators of the Aldo-induced alterations in the band 3 dimer formation.

Gli eritrociti (RBCs) sono cellule non nucleate particolarmente esposte a differenti stimoli, tra i quali l’effetto degli ormoni circolanti nel sangue e i derivati dei processi di ossidazione intra o extracellulari. Studi precedenti condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che, nel caso di malattie infiammatorie con alterazione del contenuto di GSH rispetto ai controlli, gli eritrociti erano molto più sensibili alla diamide, un blando ossidante in grado di innescare la tirosin-fosforilazione (Tyr-P) delle proteine di membrana, principalmente della proteina banda 3. L’aldosterone (Aldo), ormone mineralocorticoide, oltre alla sua classica azione regolatoria dei processi diuretici, è in grado di indurre molti altri effetti tra i quali l’espressione e l’attivazione dell’enzima NADPH ossidasi, generatore di anione superossido. Questo fatto potrebbe potenzialmente spiegare l’incremento di marker plasmatici di stress ossidativo (OS) come gli isoprostani, nell’aldosteronismo primitivo (PA), patologia caratterizzata da un’eccessiva secrezione di Aldo. Partendo da queste evidenze, gli RBCs erano cellule ottimali per studiare se l’Aldo potesse indurre un aumentato stato di ossidazione determinato da una sua azione diretta sui processi infiammatori. Infatti, in queste cellule non nucleate, un eventuale coinvolgimento dell’Aldo nei meccanismi infiammatori, mediante un’azione non-genomica, sarebbe stato univocamente dimostrato. Lo studio ha coinvolto sia pazienti con PA che controlli sani (HC) e si è svolto in tre fasi: i) in un approccio iniziale abbiamo valutato se esistessero potenziali alterazioni negli RBCs dei pazienti, procedendo, poi, con un approfondimento in vitro condotto sugli RBCs di HC per confermare o meno un diretto coinvolgimento dell’Aldo nell’indurre queste alterazioni; ii) una volta identificato come responsabile effettivo delle alterazioni riscontrate, abbiamo cercato di chiarire il meccanismo di azione dell’Aldo a livello citosolico; iii) infine, partendo dall’evidenza che l’azione dell’Aldo veniva mediata dall’attivazione del recettore citosolico, abbiamo cercato di capire il meccanismo attraverso cui questa attivazione si trasmettesse, a livello delle membrane. Nella prima parte, abbiano dimostrato che negli RBCs dei pazienti erano presenti delle alterazioni quali un incremento sia della Tyr-P della banda 3 che una sua aggregazione, suggerendo, così, che la patologia potesse essere correlata ad uno stress ossidativo come dimostrato in altre malattie infiammatorie. Inoltre, dopo aver comparato gli effetti di Aldo, cortisolo (Cort) e canrenone (Can) (aggiunti rispettivamente come agonista ed inibitore), abbiamo confermato che era proprio l’Aldo il diretto responsabile delle alterazione che, in ultima, portavano ad un aumento della quantità degli anticorpi autologhi legati alla membrana, rispecchiando una prematuro invecchiamento cellulare. Nella seconda parte dello studio, abbiamo dimostrato, per la prima volta, la presenza a livello citosolico del recettore dei mineralocorticoidi (MR), che risulta essere presente in un complesso multi-proteico di elevato peso molecolare. Inoltre, abbiamo evidenziato come solo l’Aldo inducesse la liberazione dell’MR dal complesso a formare dimeri prontamente proteolizzati in una sorta di spegnimento del segnale. Al contrario, né Cort né Can erano in grado di indurre l’attivazione del recettore. Tuttavia, poiché finora non è mai stato dimostrato se l’Aldo potesse indurre un aumento delle stato ossidativo dell’eritrocita, nella terza parte dello studio abbiamo analizzato alcuni markers di ossidazione sia a livello di membrana che di citosol. I nostri risultati indicano che nessuna modifica del contenuto di GSH o di proteine glutationilate (GSSP) era presente nei pazienti rispetto ai controlli, come nessuna alterazione nella monomerizzazione e attivazione della anidrasi carbonica (CA), nuovo parametro nella valutazione di un aumentato stato di ossidazione. Tuttavia, i nostri risultati mostrano che la proteina banda 3 risulta effettivamente sottoposta ad uno stress ossidativo che ne induce l’aggregazione attraverso la formazione di ponti disolfuro. Risultato, questo, che merita ulteriori indagini ed approfondimenti. In conclusione, abbiamo trovato che negli RBCs dei pazienti con PA l’Aldo è responsabile di alterazioni di membrana che portano ad una potenziale prematura rimozione delle cellule dalla circolazione. L’azione dell’Aldo viene mediata a livello citosolico dall’MR, ma non dal Cort. Ulteriori studi sono in corso per esplorare sia la natura che il meccanismo di potenziali mediatori dell’effetto dell’Aldo-MR a livello delle membrane eritrocitarie.