Development of new molecular diagnostic tests for personalized medicine: analysis of IL28B polymorphisms and MPL/CALR mutations

The research during this doctorate focused on the development of commercial genetic tests in the context of personalized medicine. In the first part of this project two assays were developed that allow allelic discrimination of two informative single nucleotide polymorphisms (SNPs) near the IL28B locus, which are useful for the management of patients with chronic hepatitis C infection. Hepatitis C is a significant health problem worldwide, with approximately 170 million infected people. For many years the standard of care (SOC) for HCV therapy has consisted in the administration of pegylated interferon α and ribavirin (PEG-IFN/RBV). With this therapy, however, around 80% of patients infected by genotype 2 or 3 of HCV and only 50% of those infected by genotype 1 or 4 reached a sustained virological response (SVR), which indicates complete eradication of the virus. In the last years, several studies have demonstrated that, among others, host genetic factors, such as different genotypes of rs12979860 and rs8099917 SNPs located upstream of the IL28B gene, determine the probability of attaining SVR. Patients homozygous for the favorable allele in both SNPs (CC for rs12979860 and TT for rs8099917) had a two- to three-fold higher likelihood to achieve spontaneous viral clearance in acute infections or SVR after treatment compared to patients heterozygous or homozygous for the unfavorable alleles (CT or TT for rs12979860 and TG or GG for rs8099917). Recently developed direct-acting antiviral agents (DAAs) inhibiting proteases involved in viral replication have been shown to significantly increase SVR rates in patients independently of the viral genotype, when combined with standard therapy. Two of those DAAs, boceprevir and telaprevir, were approved by the FDA in 2011 and many others are currently under investigation in order to develop an IFN-free SOC. Although the IL28B SNP genotype may have less effect on viral kinetics in the new combination therapies, there is evidence that it will continue to be relevant also in the context of IFN-free regimens. Therefore, genotyping of IL28B SNPs prior to therapy will remain fundamental to avoid ineffective treatments that are not only long and costly but, most importantly, are associated with significant side effects (e.g., flu-like syndrome, hematologic abnormalities and adverse neuropsychiatric events). The objective of this study was the development of two real-time PCR based tests for rs12979860 and rs8099917 genotyping using TaqMan® probes. Primers and probes that specifically bind the target region were designed. Probes were labeled with different fluorophores for each allele. Primer specificity to the target genomic sequence was determined using Blast and the probability of unwanted folding and secondary structures was checked with mfold. Starting from samples with a known genotype, positive controls for both assays were prepared by cloning the targeted gene region into a plasmid vector. Correct insertion of the target sequence into the plasmid was checked with Sanger sequencing. The reaction protocol was optimized by testing and comparing several amplification conditions with different master mixes and primer/probe concentrations. The reaction protocols were optimized to run on the following real-time PCR systems: Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR System, Applied Biosystems 7500 Fast and 7500 Fast Dx Real-Time PCR Systems, Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System, Bio-Rad Dx Real-Time System and Bio Rad CFX96™ Real-Time PCR Detection System. Both IL28B diagnostic devices were demonstrated to have high diagnostic specificity and sensitivity, 99.50% and 99.48% for rs12979860 and rs8099917, respectively, by analyzing around 200 samples that had been previously genotyped with a reference IVD. Using different concentrations of clinical samples, the assays were shown to work with DNA concentrations of 2 to 250 ng/µL. A reagent shelf-life of 12 months was determined following a stability study that assessed assay performances at different time points. At the end of this study, the final assays REALQUALITY RS-IL28B rs12979860 and REALQUALITY RQ-IL28B rs8099917 were notified with the Ministry of Health and placed on the market as CE-IVD commercial kits. By allowing simultaneous genotyping of both IL28B SNPs, these devices represent one of the most complete systems available for HCV patients management. Moreover, both kits have been shown to be highly sensitive and robust even under suboptimal conditions (after several freeze-thaw cycles of the amplification mix and with degraded DNA samples). The second part of this project focused on the development of two assays for the detection of the complete panel of mutations found in exon 9 of the CALR gene and for the detection and semi-quantification of the two most frequent mutations (W515L and W515K) in the MPL gene. Recently discovered somatic mutations in the gene encoding for calreticulin (CALR) have been demonstrated – together with JAK2 and MPL mutations – to be the driver mutations responsible for a subclass of myeloproliferative neoplasms (BCR-ABL1-negative MPN). To this group of MPNs belong polycythemia vera (PV), essential thrombocytemia (ET) and primary myelofibrosis (PMF). Although mutations in these three genes are not disease-specific, they have been shown to be mutually exclusive and present in the vast majority of patients with these types of neoplasms. According to relative mutation frequencies the V617F mutation in exon 14 of JAK2 is at the first place, being present in almost all PV cases (the remaining cases carry mutations in exon 12 of this gene) and in most cases of ET and PMF. CALR mutations are the second most common genetic alterations in ET and PMF, whereas the mutations in codon 515 of exon 10 of the MPL gene are the third most frequent mutation encountered in ET and PMF. Mutations in JAK2, CALR and MPL are considered to have high diagnostic and prognostic value, and are used to monitor disease progression towards myelofibrosis and leukemia. In 2014, a new revision of the World Health Organization (WHO) criteria for diagnosis of BCR-ABL1-negative MPNs has been proposed including CALR mutations as major criterion for ET and PMF together with the above-mentioned JAK2 (V617F) and MPL mutations. Compared to patients with JAK2 V617F and MPL mutations, carriers of CALR mutations have lower hemoglobin levels, lower leukocyte counts, higher platelet counts and improved thrombosis-free survival. Since tests for the identification, semi-quantification and absolute quantification of the JAK2 V617F allele are already available at AB ANALITICA, this study focused on the development of tests for detection of mutations in the CALR and MPL genes. Different molecular biology technologies were used for these two assays. The test for CALR mutations detection was based on end-point PCR and agarose gel electrophoresis, whereas the assay for analysis of the two most common MPL mutations (W515L and W515K) used real-time PCR. Primers for both assays and TaqMan® MGB probes of the MPL W515L/K assay were designed and checked as described above. Plasmid positive controls were prepared using commercial cloning kits. The protocol of the CALR MUTATION assay was optimized by testing several amplification settings and conditions, different master mix, primer concentration and number of amplification cycles, as well as by refining the visualization step (variation of agarose type, agarose density, DNA-intercalating agent, loading volumes). The MPL W515L/K assay was tested on the Applied Biosystems StepOnePlus™ Real-Time PCR System with different master mixes and concentrations of primers and probes. The diagnostic specificity and sensitivity of CALR MUTATION assay were determined on a total of 65 clinical samples: 36 wild-type samples and 29 mutated samples containing the two most common CALR mutations (Type-1 and Type-2) as well as the so-called rare CALR mutations with a sequence length that differs by at least 4 base pairs from the wild-type sequence. The assay was able to correctly discriminate all samples tested, hence the test was assigned a diagnostic specificity and sensitivity of 100%. In addition, the assay correctly typed samples in a DNA concentration range of 25 to 100 ng/reaction and the measured detection limit was 10% of mutated allele on wild-type background. Although the stability study is still on-going, a shelf-life of 6 months was assigned to the device according to the European Standard EN 13640:20021. The primers for optional Sanger sequencing included with the device were shown to be highly specific for the target region. During the development of the assay for detection of W515L/K mutations in MPL, a cut-off of 1.5% of mutated allele was established. This cut-off allowed the correct identification of all tested wild-type samples (11 in total). The assay was able to detect and correctly semi-quantify 1/1 sample with the W515K mutation and 4/4 samples with the W515L mutation. When using samples with other mutations in or close to codon 515, no amplification signal of the mutated sequence was generated, due to the high specificity of the probes for the W515L and W515K mutations. As a conclusion of this study, the completed device GENEQUALITY CALR MUTATION was notified with the Ministry of Health and placed on the market as the first commercial CE-marked IVD device for detection and identification of mutations in exon 9 of the CALR gene. Concerning the MPL W515L/K assay, the design of new probes for the detection of all mutations in codon 515 of MPL was decided and is currently on going.

L’attività di ricerca di questo Dottorato ha avuto come obiettivo quello di sviluppare test genetici di interesse commerciale nell’ambito della medicina personalizzata. La prima parte di questo progetto ha riguardato lo sviluppo di due saggi per la discriminazione allelica di due polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) vicini al locus di IL28B che svolgono un ruolo fondamentale nella gestione dei pazienti con epatite C cronica. L’epatite C è uno dei maggiori problemi di salute pubblica a livello globale; si stima infatti che vi siano circa 170 milioni di individui affetti da epatite C al mondo. Per molti anni la terapia definita come “standard of care” (SOC) per la cura dell’epatite C si è basata sulla somministrazione combinata di interferone alfa peghilato e ribavirina (PEG-IFN/RBV). Con questa terapia, però, circa l’80% dei pazienti infettati dai genotipi 2 e 3 di HCV e solo il 50% di quelli infettati dai genotipi 1 e 4 erano in grado di raggiungere una risposta virologica sostenuta (SVR) con l’eradicazione completa del virus. Negli ultimi anni, diversi studi hanno dimostrato in modo indipendente che fattori genetici legati all’ospite, quali il genotipo dei polimorfismi rs12979860 e rs8099917 a monte del gene IL28B, sono correlati alla probabilità di raggiungere SVR. Si è infatti osservato che i pazienti omozigoti per l’allele favorevole in entrambi i polimorfismi (CC per rs12979860 e TT per rs8099917) raggiungevano una clearance virale spontanea nelle infezioni acute oppure una SVR dopo il trattamento in quelle croniche, con una probabilità 2-3 volte maggiore rispetto ai pazienti eterozigoti o omozigoti per l’allele sfavorevole (CT o TT per rs12979860 e TG o GG per rs8099917). Recentemente, l’uso di nuovi agenti antivirali ad azione diretta (DAA) che inibiscono le proteasi coinvolte nel ciclo replicativo di HCV, in combinazione con la terapia standard ha permesso di ottenere un aumento significativo dei tassi di SVR nei pazienti indipendentemente dal genotipo virale dell’infezione. Due di questi, boceprevir e telaprevir, sono stati approvati dall’FDA nel 2011 e molti altri sono attualmente in fase di sviluppo per arrivare a definire una nuova terapia SOC non più basata sull’utilizzo di interferone. Nonostante l’effetto dei genotipi dei polimorfismi di IL28B sulla cinetica virale sembri risultare indebolito dall’uso di questi potenti agenti antivirali nella terapia, dati sperimentali indicano che le varianti genetiche di questi SNP rimarranno fortemente informative anche nel contesto dei futuri regimi IFN-free. Pertanto, la genotipizzazione degli SNP di IL28B prima della terapia è fondamentale allo scopo di evitare un trattamento inefficace caratterizzato non solo da tempi lunghi e costi elevati ma soprattutto da pesanti effetti collaterali (come ad esempio sindrome di tipo influenzale, anormalità ematologiche ed eventi avversi neuropsichiatrici). Lo scopo di questo studio è stato quindi sviluppare due test per la genotipizzazione di rs12979860 e rs8099917 basandosi sul metodo della real-time PCR con sonde TaqMan®. Sono stati disegnati i primer e le sonde per l’ibridazione specifica con la sequenza target di DNA. Le sonde sono state marcate con fluorofori specifici per ciascun allele. La specificità dell’appaiamento dei primer alla sequenza genomica di interesse è stata verificata mediante il tool bioinformatico di allineamento Blast mentre l’assenza di strutture secondarie o folding indesiderati è stata confermata con il programma mfold. Utilizzando campioni clinici con genotipo noto degli SNP di IL28B, i controlli positivi di entrambi i saggi sono stati preparati mediante clonaggio della regione target all’interno di un vettore plasmidico. La corretta inserzione della sequenza target nel plasmide è stata accertata mediante sequenziamento di Sanger. Il protocollo di reazione è stato ottimizzato confrontando tra loro diverse condizioni sperimentali con cui sono state testate diverse master mix di amplificazione e concentrazioni di primer e sonde. I protocolli di reazione sono stati ottimizzati per funzionare con i seguenti strumenti: Applied Biosystems StepOne™ e StepOnePlus™ Real-Time PCR System, Applied Biosystems 7500 Fast e 7500 Fast Dx Real-Time PCR Systems, Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System, Bio-Rad Dx Real-Time System e Bio Rad CFX96™ Real-Time PCR Detection System. Sensibilità e specificità diagnostiche sono state calcolate analizzando per ciascun saggio circa 200 campioni precedentemente genotipizzati con un IVD di riferimento, e sono risultate rispettivamente pari al 99,50% per rs12979860 e al 99,48% per rs8099917. Il range di concentrazioni del DNA entro il quale le performance del test rimangono invariate è stato determinato usando campioni di DNA a diverse concentrazioni. Si è visto che entrambi i saggi assegnano correttamente il genotipo a campioni con concentrazioni di DNA comprese tra 2 e 250 ng/µL. In seguito ad uno studio di stabilità durante il quale sono state misurate le performance del test a vari intervalli di tempo, è stato possibile attribuire ai reagenti di entrambi i saggi una shelf-life di 12 mesi. I test messi a punto in questo studio, REALQUALITY RS-IL28B rs12979860 e REALQUALITY RQ-IL28B rs8099917, sono stati infine notificati al Ministero della Salute e immessi nel mercato come kit commerciali CE-IVD. Questi dispositivi, permettendo la genotipizzazione dei due SNP di IL28B nella stessa seduta, rappresentano uno dei sistemi commerciali più completi per la gestione dei pazienti con HCV. Inoltre, entrambi i kit hanno dimostrato di essere molto sensibili ed affidabili anche in condizioni non ottimali (ad esempio dopo ripetuti cicli di gelo-scongelo della mix di amplificazione oppure utilizzando campioni degradati). La seconda parte di questo progetto ha avuto come scopo lo sviluppo di due saggi, uno per la rilevazione delle mutazioni note nell’esone 9 di CALR, l’altro per la rilevazione e la semi-quantificazione delle due mutazioni più frequenti di MPL (W515L e W515K). Le mutazioni somatiche nel gene codificante per la calreticulina (CALR) scoperte recentemente, assieme a quelle nei geni JAK2 e MPL, sono ritenute essere le mutazioni “driver” alla base della sottoclasse di neoplasie mieloproliferative (MPN) BCR-ABL1-negative. La policitemia vera (PV), la trombocitemia essenziale (ET) e la mielofibrosi primaria (PMF) fanno parte di questo gruppo di MPN. Le mutazioni in JAK2, CALR e MPL, pur non essendo specifiche per la malattia, sono presenti nella maggior parte dei pazienti con tali neoplasie in modo mutuamente esclusivo. La mutazione V617F nell’esone 14 di JAK2 è la più frequente in tutte le patologie considerate, essendo presente nella quasi totalità dei pazienti con PV (nei rimanenti casi si riscontrano mutazioni nell’esone 12 di JAK2) e nella maggior parte dei pazienti con ET o PMF. Le mutazioni di CALR sono presenti con una frequenza inferiore rispetto a JAK2 V617F nelle ET e PMF. Infine, le mutazioni nel codone 515 dell’esone 10 di MPL sono quelle presenti con la minor frequenza nelle ET e PMF. Le mutazioni in questi tre oncogeni, oltre che per la diagnosi e la prognosi, vengono anche utilizzate per monitorare la progressione della malattia verso forme più aggressive, quali leucemia e mielofibrosi. I criteri della WHO (World Health Organization) per la diagnosi delle MPN BCR-ABL1-negative, in particolare ET e PMF, sono attualmente in stato di revisione a seguito della proposta avanzata nel 2014 per l’inserimento delle mutazioni di CALR tra i criteri diagnostici maggiori accanto alle mutazioni di JAK2 (V617F) e MPL già presenti. È stato inoltre osservato che le mutazioni di CALR, rispetto a JAK2 V617F e alle mutazioni di MPL, sono associate ad un fenotipo caratterizzato da livelli inferiori di emoglobina, minor numero di leucociti, maggior numero di piastrine e maggiore sopravvivenza priva di trombosi. Siccome AB ANALITICA ha già sviluppato dei test per l’identificazione, la semi-quantificazione e la quantificazione assoluta dell’allele JAK2 V617F, questo studio aveva l’obiettivo di sviluppare due test per la rilevazione delle mutazioni in CALR ed MPL al fine di completare il pannello delle principali mutazioni associate alle MPN BCR-ABL1-negative. Dovendo rilevare mutazioni di tipo diverso (inserzioni e/o delezioni in CALR e due mutazioni puntiformi in MPL), si è scelto di usare per i due saggi due differenti tecnologie, vale a dire end-point PCR con elettroforesi in gel d’agarosio per le mutazioni di CALR e real-time PCR per le mutazioni W515L e W515K di MPL. Seguendo il modello descritto in precedenza, sono stati disegnati i primer di entrambi i test e le sonde TaqMan® MGB per il saggio di MPL W515L/K ed è stato verificato il loro appaiamento specifico alla regione target. I controlli positivi plasmidici di entrambi i sistemi sono stati preparati utilizzando kit commerciali per il clonaggio. Il protocollo del saggio per la rilevazione delle mutazioni di CALR è stato ottimizzato dopo aver testato diverse condizioni sperimentali sia per la reazione di amplificazione (variando master mix, concentrazione dei primer, numero di cicli di amplificazione) che per la visualizzazione (variando tipo di agarosio, densità del gel, agente intercalante del DNA, volumi da caricare nel gel). Una fase preliminare di messa a punto del saggio per la rilevazione delle mutazioni di MPL è stata effettuata sullo strumento StepOnePlus™ (Applied Biosystems) testando diverse master mix e concentrazioni di primer e sonde. Sensibilità e specificità diagnostiche del saggio delle mutazioni di CALR sono state calcolate utilizzando un totale di 65 campioni clinici di cui 36 wild-type e 29 mutati. Tutte le mutazioni analizzate in questo studio (Tipo-1, Tipo-2 e mutazioni rare) sono state precedentemente determinate mediante sequenziamento bidirezionale con cui si è visto che alterano la lunghezza della sequenza di almeno 4 paia di basi rispetto alla sequenza wild-type. Il saggio ha dimostrato di saper discriminare correttamente lo status di tutti i campioni testati (mutato vs wild-type), perciò gli è stata attribuita un’accuratezza (osservato/atteso) del 100%. Testando diluizioni seriali di allele mutato in un background di allele wild-type è stato identificato il limite di rilevabilità del saggio pari al 10% di allele mutato. Il test ha inoltre dimostrato di discriminare correttamente campioni con concentrazioni di DNA tra 25 e 100 ng/reazione. Nonostante lo studio di stabilità sia attualmente in corso, è stata attribuita ai reagenti una shelf-life di 6 mesi secondo la norma europea EN 13640:20021. I primer per il sequenziamento di Sanger (facoltativo) che consente l’identificazione della mutazione sono risultati altamente specifici per la regione target. Nelle prove preliminari del saggio per la rilevazione delle mutazioni W515L/K di MPL, è stato stabilito un cut-off dell’ 1,5% di allele mutato con cui sono stati correttamente discriminati 11/11 campioni wild-type. Il saggio è stato in grado di rilevare e semi-quantificare correttamente 1/1 campione con la mutazione W515K e 4/4 campioni con la mutazione W515L. Utilizzando però campioni con una mutazione diversa nel codone 515 o nelle sue vicinanze non è stato riscontrato alcun segnale di amplificazione relativo alla sequenza mutata, indice di una elevata specificità delle sonde per le due mutazioni W515L e W515K. In conclusione, questo studio ha portato allo sviluppo del dispositivo GENEQUALITY CALR MUTATION che è stato notificato al Ministero della Salute ed è il primo kit CE-IVD che permette di rilevare ed identificare le mutazioni nell’esone 9 del gene CALR. Per quanto riguarda il saggio di MPL W515L/K, è stato deciso ed è attualmente in corso il disegno di nuove sonde per la rilevazione di tutte le mutazioni nel codone 515 di MPL.