MicroRNAs impact in cancer: from non canonical biogenesis and functions to methodological aspects

The DNA information appears nowadays more stratified than it was supposed to be a decade before. In this scenario, non coding RNAs have been introduced in the fraction of functional RNA, carrying information and underpinning regulatory circuits of complex genetic phenomena in eukaryotes. microRNAs are endogenous single stranded ~22 nt long transcripts among that unveiled non coding RNA with regulatory functions, detected both in animals and plants. Increasing evidence shows that deregulation of microRNAs (miRNAs) plays an important role in both solid and hematologic malignancies. In this work we considered microRNA non canonical functions and involvement in tumours, integrating computational analyses of genome-wide datasets and targeted experimental results, with a critical approach to the specific adopted computational tools. First, we studied miRNAs role in myeloproliferative disorders, more specifically in primary myelofibrosis, considering also other small RNAs detected in RNA-seq data. Myeloproliferative neoplasms are chronic myeloid cancers involving CD34+ hematopoietic stem cells alterations, evolving to acute leukemia in the most severe forms. This study deals indeed with an Illumina sequencing of small RNAs samples of CD34+ hematopoietic stem cells of patients affected by primary myelofibrosis and of controls, in order to characterize miRNAs profile and find relevant differentially expressed elements, as putative effectors of a disrupted post-transcriptional regulation involved in PMF initiation and progression. Then, in order to have a better understanding of each step of a computational analysis of RNA-seq data, we studied the impact on small RNAs differential expression analysis of normalization methods developed for long RNA. We evaluated five commonly used normalization methods to pinpoint a procedure to perform a robust RNA-seq analysis. We estimated statistical distribution parameters from a real microRNA numerous dataset and we simulated a huge number of small RNAs dataset. We controlled datasets characteristics in order to generate 9 different testing scenarios and measure the normalization impact on differentially expressed elements recognition, through ROC and AUC curves. We ascertain that normalization methods still need strong efforts in developing new algorithms in order to fill the wide room for improvement. Thereafter we evaluated the implication of microRNAs in the gene expression changes observed after H-ferritin silencing. We explored whether different FHC amounts might modulate miRNA expression levels in K562 cells and we studied the impact of miRNAs in gene expression profile modifications. To this aim, we performed a miRNA-mRNA integrative analysis in K562 silenced for FHC (K562shFHC) comparing it with K562 transduced with scrambled RNA (K562shRNA). The remarkable up-regulation of four miRNAs, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i-5p and hsa-miR-125b-5p, in silenced cells and their down-regulation when FHC expression was rescued supported a specific relation between FHC silencing and miRNA-modulation. The integration of target predictions with miRNA and gene expression profiles led to the identification of a regulatory network. Our data, confirmed by an experimental validation, indicate that, FHC silencing may affect RAF1/pERK1/2 levels through the modulation of a specific set of miRNAs and they add new insights to the relationship among iron homeostasis and miRNAs. We further explored a putative non canonical role of microRNAs, more specifically, in the context of the always more evident complex cross talk between protein-coding and non-protein coding RNAs. We worked on a preliminary study that deals with the involvement of microRNAs in the regulation of alternative translation (AT) and thus of protein isoform equilibrium. There is an increasing appreciation of the high prevalence of alternative translation in mammals. Complex and regulated translation pattern are achieved thanks to multiple Open Reading Frame (ORFs) and Translation Initiation Sites (TISs) in the same mRNA that can influence each other in different ways. miRNAs were recently demonstrated to be involved in modulation of protein isoform equilibrium binding to TISs. We provided novel data on the overlap of active TISs of mRNAs, experimentally defined using GTI-seq, to miRNA-binding sites, experimentally determined using CLASH technique. The genes whose sites were recognized are supposed to be involved in miRNA-modulated AT and we modelled the interaction mechanism. The miRNA-based regulation of mRNA alternative translation surely deserves further investigation to clarify if and how it impacts on cell processes and on disease.

L’informazione contenuta nel DNA appare oggi sempre più stratificata di quanto non si pensasse. In questo scenario, gli RNA non codificanti sono stati riconosciuti come RNA funzionali, portatori di informazione e parti fondamentali dei più complessi circuiti regolativi negli eucarioti. Tra i più studiati RNA non codificanti con funzioni regolative ci sono i microRNA (miRNA), RNA a singolo filamento lunghi circa 22 nucleotidi, presenti sia in piante che animali. Ci sono prove sempre più evidenti che la deregolazione dei miRNA abbia un ruolo fondamentale nei tumori solidi e del sangue. In questo lavoro abbiamo preso in considerazione le funzioni non canoniche dei miRNA, il loro coinvolgimento nei tumori, integrando analisi computazionali di dati genome-wide e dati sperimentali più specifici, con un approccio critico rispetto gli strumenti computazionali. Abbiamo innanzitutto studiato il ruolo dei miRNA nelle neoplasie mieloproliferative, più specificamente nella mielofibrosi, considerando anche altri small RNA presenti nei dati RNA-seq. Le malattie mieloproliferative sono tumori cronici della linea mieloide che vedono l’alterazione delle cellule emopoietiche CD34+, ed evolvono in leucemia acuta nei casi più gravi. In questo studio abbiamo pertanto analizzato dati di RNA-seq, prodotti con tecnologia Illumina, di cellule raccolte da pazienti affetti da mielofibrosi primaria e da controlli sani, al fine di caratterizzare i profili di microRNA e trovare gli elementi differenzialmente espressi, in quanto possibili elementi di regolazione post trascrizionale alterata e coinvolti nella genesi e nello sviluppo della mielofibrosi. Successivamente, al fine di aver piena consapevolezza dei vari passi di un’analisi computazionale, abbiamo studiato l’impatto dell’applicazione su dati di RNA corti di algoritmi di normalizzazione, sviluppati per RNA lunghi, valutato a livello dei risultati dell’analisi differenziale. Abbiamo preso in considerazione cinque tra i più comunemente usati algoritmi, per individuare la procedura che permetta di svolgere in modo più robusto l’analisi di dati RNA-seq. Abbiamo stimato i parametri della distribuzione statistica di un dataset reale di microRNA particolarmente numeroso, e abbiamo simulato un numero sostanzioso di dataset. Abbiamo generato nove tipi di data set con diverse caratteristiche controllate e abbiamo misurato l’impatto della normalizzazione nei vari casi, quantificando l’impatto sull’analisi differenziale attraverso curve ROC e AUC. Abbiamo evidenziato la necessità di nuovi algoritmi di normalizzazione, più specifici per i miRNA, in grado di colmare le grosse lacune dei metodi attuali. Ci siamo in seguito concentrati sul coinvolgimento dei microRNA nei cambiamenti dei valori di espressione genica, rilevati in cellule K562 in cui fosse silenziata la ferritina FHC. Abbiamo indagato se diversi livelli di FHC potessero modulare i livelli di espressione dei microRNA e abbiamo monitorato l’impatto dei miRNAs rispetto le modificazioni dei livelli d’espressione dei geni. A tal fine abbiamo, condotto un’analisi integrata di miRNA-mRNA in cellule K562 silenziate per la FHC (K562shFHC) confrontandole con cellule K562 trasdotte con RNA scrambled (K562shRNA). La notevole up-regolazione di quattro miRNA, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i-5p e hsa-miR-125b-5p, nelle cellule silenziate e il fatto che i loro livelli di espressione scendessero quando fosse riattivata l’espressione di FHC, supporta l’esistenza di una relazione tra FHC e la modulazione dei miRNA. Integrando le informazioni sui target dei miRNA e i profili di espressione dei geni, abbiamo identificato dei network regolativi. I nostri dati, confermati con validazioni sperimentali, indicano che il silenziamento di FHC potrebbe impattare sui livelli di RAF1/pERK1/2 attraverso la modulazione di specifici gruppi di microRNA, fornendo nuove informazioni sul rapporto tra omeostasi del ferro e miRNA. Infine, ci siamo occupati di un ruolo non canonico dei microRNA, più specificamente nel contesto delle sempre più evidenti interazioni tra RNA codificanti e RNA non codificanti. Abbiamo condotto uno studio preliminare sul coinvolgimento dei microRNA nella regolazione della traduzione alternativa e di conseguenza dell’equilibrio delle varie isoforme proteiche. C’è una maggior consapevolezza della diffusione del meccanismo della traduzione alternativa nei mammiferi. Si realizzano pattern complessi di regolazione delle isoforme grazie alla presenza, nello stesso mRNA, di più Open Reading Frame (ORF) e Translation Initiation Sites (TISs) utilizzati. Questi sono in grado di influenzarsi a vicenda in maniera diversa. E’ stato recentemente dimostrato che i miRNA sono coinvolti nella modulazione dell’equilibrio delle isoforme proteiche, legandosi ai TIS. Noi abbiamo individuato la corrispondenza di siti TIS attivi nei trascritti di mRNA, trovati sperimentalmente con GTI-seq, e siti di legame di miRNA nelle sequenze di mRNA, determinati sperimentalmente con tecnica CLASH. Questi geni in cui sono stati riconosciuti siti di legame, si suppongono coinvolti in un meccanismo di traduzione alternativa modulata da miRNAs. Alcune interazioni miRNA-tis sono state confermate sperimentalmente, ma ulteriori studi sono necessari per valutare se il meccanismo di modulazione della traduzione alternativa da parte dei miRNA possa impattare su processi cellulari e nella malattia.