NMR based Metabolomics in Food Chemistry

Metabolomics is defined as the systematic analysis of hundreds or thousands of small metabolites present in a living system. It has emerge as an important field of study along with other, already established ‘omics’ sciences, i.e., genomics, proteomics and transcriptomics. Metabolomics is well established in the field of medicine, drug toxicity and disease diagnosis. Among the existing analytical techniques, NMR is a fast, reproducible and non-destructive technique to construct an informative snapshot of the metabolites under certain conditions. NMR data give metabolic signature information of the samples when it is combined with data preprocessing and chemometric tools, such as multivariate statistical techniques. NMR-based metabolomics is still expanding in the field of the food chemistry. In this context, this Ph.D. thesis is focused on two major aspects, which show applications of NMR-based metabolomics in food chemistry. 1. Many nutraceutical products possess powerful antioxidant activity as demonstrated in many chemical in vitro tests and in several in vivo trials. Nevertheless, the mechanism of their activity is not completely studied in detail. Due to their poor bioavailability and fast metabolism, studies on the in vivo antioxidant effects are still needed. We performed longitudinal experiments on Sprague Dawley (SD) rats using two commonly available nutraceutical antioxidant products, namely, Curcumin (chapter 2) and Resveratrol (chapter 3). The effects of different doses of orally administered standardized antioxidant extracts in healthy rats were investigated by untargeted metabolomic analysis based on LC-MS and NMR spectrometry. The experiments were carried out over different periods of time for different antioxidants. Changes in the urinary metabolome were evaluated by monitoring the 24-hour urine composition by 1H-NMR and HPLC-MS. The two different approaches were able to detect variations in the urinary levels of antioxidant markers, leading to the observation of different metabolites thus proving the complementarity of these two analytical techniques for metabolomic purposes. Analytical tools such as MS and NMR spectroscopy in combination with chemometrics can profile the impact of time, stress, nutritional status, and environmental perturbations on hundreds of metabolites simultaneously. This results in complex, massive data sets that must be analyzed through a careful statistical protocol. Our strategy included data preprocessing, data analysis and validation of statistical models. After several data processing steps, principal component analysis (PCA) and partial least-squares (PLS) were used to identify urine biomarkers. The PLS models were validated by permutation tests and critically important variables were validated through univariate analysis. 2. The second part of this thesis (chapters 4 and 5) describe the use of NMR-based metabolomics as a fast, convenient, and effective tool for origin discrimination and biomarker discovery in food analysis. Traditionally, the determination of the floral origin of honey is made from palynological analysis. The method is based on the identification of pollen by microscopic inspection. However, melissopalynological analysis needs expertise and also it is not a very reliable technique for the discrimination of botanical origin of some types of honey. Also, honey regulation in the EU (Codex Alimentarius Commission 2001; European Commission 2002) emphasizes that the botanical and geographical origins of the product must be printed on the label in order to avoid the fraud such as adulteration with industrial sugar, selling product under false name or mixing the honey of different floral origin. Therefore, there is need to establish a method to discriminate honey from different origin. The aim of this work was to develop an NMR-based metabolomic approach that used multivariate statistical analysis to discriminate the botanical (chapter 4) and entomological (chapter 5) origin of different types of honey. Multivariate statistical analysis helped us to identify the most relevant signals to differentiate honey botanically and entomologically. The obtained data sets were useful in the search of markers responsible for the discrimination of different honey samples from different botanical species and produced by different bee species.

La metabolomica è definita come l'analisi sistematica di centinaia o migliaia di piccoli metaboliti presenti in un sistema vivente. È emerso come un importante campo di studio insieme ad altre, già affermate scienze "omiche", vale a dire, genomica, proteomica e trascrittomica. La metabolomica è ben consolidata nel campo della medicina, nello studio della tossicità di farmaci e nella diagnostica. Tra le tecniche analitiche esistenti, NMR è veloce, riproducibile e non distruttiva, utile per fornire una fotografia informativa sui metaboliti in determinate condizioni. Dati NMR forniscono informazioni metaboliche che caratterizzano i campioni quando combinati con una pre-elaborazione dei dati e con strumenti chemiometrici, come le tecniche di statistica multivariata. La metabolomica basata sull’NMR è ancora in espansione nel campo della chimica degli alimenti. In questo contesto, questa tesi di Dottorato si concentra su due aspetti principali, che mostrano applicazioni della metabolomica basata sull’NMR in chimica degli alimenti. 1. Molti prodotti nutraceutici possiedono potente attività antiossidante, come dimostrato in molti test chimici in vitro e in diverse prove in vivo. Tuttavia, il meccanismo della loro attività non è completamente studiato in dettaglio. A causa della loro scarsa biodisponibilità e metabolismo veloce, sono ancora necessari studi in vivo sugli effetti antiossidanti. Abbiamo condotto esperimenti longitudinali su ratti Sprague Dawley (SD) utilizzando due prodotti antiossidanti nutraceutici comunemente disponibili, vale a dire, curcumina (capitolo 2) e resveratrolo (capitolo 3). Gli effetti di diverse dosi di estratti antiossidanti standardizzati somministrati per via orale nei ratti sani sono stati studiati mediante analisi metabolomica non mirata (untargeted) basata su LC-MS e spettrometria NMR. Gli esperimenti sono stati eseguiti lungo diversi periodi di tempo per diversi antiossidanti. Le variazioni del metaboloma urinario sono state valutate attraverso il monitoraggio della composizione delle urine di 24 ore usando 1H-NMR e HPLC-MS. I due differenti approcci sono stati in grado di rilevare le variazioni dei livelli urinari di marcatori antiossidanti, portando all’osservazione di diversi metaboliti e dimostrando così la complementarità di queste due tecniche analitiche per scopi metabolomici. Strumenti di analisi come la spettroscopia NMR e MS in combinazione con chemiometria possono delineare l'impatto del tempo, dello stress, dello stato nutrizionale, e di perturbazioni ambientali su centinaia di metaboliti contemporaneamente. Ciò comporta complessi enormi set di dati che devono essere analizzati mediante un protocollo statistico accurato. La nostra strategia ha compreso una pre-elaborazione dei dati, l’analisi dei dati e la validazione dei modelli statistici. Dopo varie fasi di elaborazione di dati, l’analisi delle componenti principali (PCA) e l’analisi dei minimi quadrati parziali (PLS) sono state utilizzate per identificare i biomarcatori urinari. I modelli PLS sono stati convalidati dai test di permutazione e le variabili di importanza critica sono stati convalidati attraverso analisi univariata. 2. La seconda parte di questa tesi (capitoli 4 e 5) descrivono l'uso di metabolomica basata su NMR come strumento veloce, conveniente ed efficace per la discriminazione di origine e la scoperta di biomarcatori in analisi degli alimenti. Tradizionalmente, la determinazione dell'origine floreale del miele è condotta mediante analisi palinologica. Il metodo si basa sulla individuazione di polline mediante ispezione microscopica. Tuttavia, l'analisi melissopalinologica richiede perizia ed inoltre non è una tecnica molto affidabile per la discriminazione di origine botanica di alcuni titpi di miele. Inoltre, la regolamentazione del miele nell'Unione Europea (Codex Alimentarius 2001; Commissione Europea 2002) sottolinea che le origini botaniche e geografiche del prodotto devono essere stampate sull'etichetta, per evitare frodi, come l'adulterazione con zucchero industriale, vendita di prodotti sotto falso nome o aggiunte di miele di diversa origine floreale. Pertanto, vi è la necessità di stabilire un metodo per distinguere miele di diverse origini. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un approccio metabolomico basato sull’NMR che ha utilizzato l'analisi statistica multivariata per discriminare l'origine botanica (capitolo 4) ed entomologica (capitolo 5) di diversi tipi di miele. statistica multivariata ci ha aiutato ad identificare i segnali più importanti per differenziare il miele sia dal punto di vista botanico che entomologico. I set di dati ottenuti sono stati utili nella ricerca di marcatori responsabili della discriminazione dei diversi campioni di miele di diverse specie botaniche e prodotti da diverse specie di api.