Signaling and transcriptomics at the degenerating-regenerating neuromuscular junction

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized tripartite synapse that allows the transmission of an electrical impulse travelling along the axon to the muscle. It is composed of the motor axon terminal (MAT), covered by perisynaptic Schwann cells (PSCs), and the muscle fibre (MF), which are separated by a basal lamina. The NMJ is not protected by anatomical barriers: it can be therefore exposed to traumas, to the attack of many pathogens including neurotoxins, and affected by many neuromuscular diseases such as amyotrophic lateral sclerosis and immune-mediated disorders, such as the Guillain-Barré and Miller Fisher syndromes. For these reasons and for its essential role in life and survival the NMJ has retained throughout vertebrate evolution an intrinsic ability for repair and regeneration, differently from central synapses. After nerve injury the glial cells of the NMJ, the PSCs, acquire a regenerative phenotype and release a series of factors that act on the stump of the MAT, providing several cues to promote neuronal regeneration. Following peripheral nerve injury, many changes taking place at the NMJ have been reported so far, but the inter- and intra-cellular signaling that occur during MAT degeneration and, more importantly, those governing the ensuing regeneration are not completely understood. We have recently established a model to study NMJ degeneration and regeneration in mice based on the specific action of -latrotoxin, a presynaptic neurotoxin isolated from the venom of the black widow spider, which targets specifically the presynaptic terminal causing its complete degeneration. Following intoxication and the subsequent clearing of MAT debris by PSCs, the axon stump regrows in few days in mice allowing complete NMJ recovery. This toxin represents therefore a simple and controlled method to induce an acute, localized and reversible nerve terminal degeneration not blurred by inflammation, and can help to identify molecules involved in the intra- and inter-cellular signalling governing NMJ regeneration. In the search of candidate molecules involved in triggering and sustaining nerve recovery we choose to perform a transcriptomic analysis of the mouse NMJs at different time points after injection of -latrotoxin. This approach has been very challenging: to our knowledge a transcriptomic analysis of the sole NMJ was never reported before. We succeeded in collecting a number of NMJs suitable for RNA isolation and sequencing of both coding and non–coding RNAs. Among the coding transcripts we selected a series of messenger RNAs (mRNAs) that are expressed at low level in controls, at higher levels during regeneration, and then return to basal when substantial regeneration is attained and we selected the mRNA encoding for the chemokine CXCL12. We found that CXCL12 is produced by PSCs during nerve degeneration, and that intraperitoneal injection of a neutralizing antibody for CXCL12 slows down the regeneration process. Moreover, the exposure of primary motor neurons to the recombinant chemokine stimulates neurite growth. These data suggest that CXCL12 is an important factor released by PSCs with a crucial role in the nerve terminal regeneration process. Parallely, we looked for molecules released by injured neurons that could activate SCs and stimulate nerve regeneration. We found that ATP released by intoxicated neurons activates a series of intracellullar signaling pathways in SCs including Ca2+, adenylate cyclase, ERK 1/2 and CREB, that are of fundamental importance for the recovery of nerve function. We propose ATP as an important alarm signal partecipating in the cross-talk between degenerating nerve terminals and adjacent PSCs not only in a model of degeneration by a spider toxin, but also in different forms of neurodegeneration of the presynaptic nerve terminal.

La giunzione neuromuscolare è una regione anatomica altamente specializzata in cui i segnali elettrici che corrono lungo l’assone del motoneurone sono convertiti in segnali chimici, che vengono a loro volta riconosciuti dalle cellule muscolari causandone la contrazione. E’ composta dal terminale assonico del motoneurone, dalle cellule di Schwann perisinaptiche che avvolgono quest’ultimo, dalla fibra muscolare e dalla lamina basale. La giunzione neuromuscolare non è protetta da barriere anatomiche e pertanto può essere bersaglio di differenti patogeni come virus, batteri, tossine. Inoltre la giunzione può essere affetta da diverse patologie quali la sclerosi laterale amiotrofica o la Sindrome di Guillain-Barrè di origine autoimmune. Per questi motivi e per la sua funzione fisiologica essenziale per la vita degli animali, non sorprende dunque la capacità della giunzione neuromuscolare di rigenerare e recuperare la sua funzionalità a seguito di differenti tipi di danno. Questa abilità si è mantenuta durante l’evoluzione animale, e differenzia le sinapsi del sistema nervoso periferico da quelle del centrale, che non hanno invece capacità rigenerativa. In seguito a denervazione le cellule di Schwann perisinaptiche mostrano una grande plasticità, de-differenziando ed iniziando a proliferare. Esse partecipano attivamente ai processi di rigenerazione nervosa, contribuendo al rilascio di diversi fattori in grado di agire sul terminale nervoso degenerato promuovendone la ricrescita ed il pieno recupero della sua funzionalità. Sono ancora poco conosciuti gli eventi intra- ed inter-cellulari che avvengono alla giunzione durante la degenerazione e soprattutto quelli che governano il processo rigenerativo del terminale nervoso. A tale scopo, nel nostro laboratorio è stato messo a punto un approccio sperimentale innovativo che permette di studiare la degenerazione e rigenerazione della giunzione neuromuscolare sfruttando il meccanismo d’azione di una neurotossina presinaptica animale, α-Latrotoxin, presente nel veleno dei ragni del genere Latrodectus. Questa tossina agisce selettivamente a livello della membrana presinaptica del motoneurone, inducendo un danno acuto e localizzato del terminale nervoso. Il terminale degenera rapidamente ma in breve tempo, in seguito alla rimozione dei detriti neuronali da parte delle cellule di Schwann, è in grado di ricrescere e di riacquisire una piena funzionalità. L’azione di tali neurotossine rappresenta quindi un sistema appropriato e controllato per indurre una degenerazione acuta, localizzata e reversibile del terminale nervoso, evitando il coinvolgimento di molti tipi cellulari e mediatori dell’infiammazione come accade nel corso della degenerazione indotta da cut/crush del nervo sciatico, tradizionalmente utilizzato fino ad oggi. Questo approccio può dunque aiutare a definire i meccanismi molecolari ed identificare i segnali intra- ed inter-cellulari alla base della degenerazione e rigenerazione nervosa. Con lo scopo di identificare molecole in grado di promuovere la rigenerazione del terminale nervoso, abbiamo messo a punto un protocollo che ci ha permesso di ottenere per la prima volta un’analisi trascrizionale a livello di giunzione neuromuscolare durante le diverse fasi di degenerazione e rigenerazione del terminale nervoso periferico in seguito ad intossicazione con α-latrotoxin. Abbiamo isolato e sequenziato da un numero adeguato di giunzioni RNA codificanti e non. Tra i diversi trascritti abbiamo selezionato quelli che presentavano un basso valore di espressione nel controllo, un aumento durante le fase rigenerativa per poi tornare ad un livello basale quando la rigenerazione è conclusa. Tra questi abbiamo approfondito lo studio della chemochina CXCL12, dimostrando che viene prodotta dalle cellule di Schwann terminali durante la degenerazione nervosa, e che l’iniezione intraperitoneale di un anticorpo neutralizzante comporta un ritardo nel processo rigenerativo. Inoltre abbiamo dimostrato che questa chemochina è in grado di promuovere la crescita dei neuriti di motoneuroni in coltura. Questi risultati suggeriscono come CXCL12 sia un importante fattore rilasciato dalle cellule di Schwann perisinaptiche con un ruolo cruciale nei processi rigenerativi del terminale nervoso. Parallelamente abbiamo indagato quali potessero essere i segnali di allarme rilasciati dal terminale nervoso in degenerazione in grado di attivare le cellule di Schwann e di promuovere la rigenerazione nervosa. Abbiamo dimostrato che l’ATP viene rilasciato da neuroni in seguito ad intossicazione con α-latrotoxin, ed è in grado di attivare nelle cellule di Schwann diverse vie di segnalazione intracellulari quali il calcio, l’AMP ciclico, ERK1/2, CREB, importanti per il recupero della funzionalità nervosa in seguito a danno. I dati presentati in questa tesi identificano l’ATP come importante molecola segnale nella comunicazione tra il terminale nervoso in degenerazione e le vicine cellule di Schwann perisinaptiche, ed estendono tale ruolo anche ad altre forme di degenerazione del terminale nervoso presinaptico.