INCREASED SURVIVAL OF CLL B CELLS IN THE PRESENCE OF MARROW MESENCHYMAL STROMAL CELLS: A NOVEL MODEL TO DEFINE NEW TARGETS FOR THERAPY

Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is the most common leukemia in the Western World, accounting for about 30% of adult leukemia, and it is characterized by the clonal expansion and accumulation of mature CD19+/CD5+/CD23+ B lymphocytes in the peripheral blood, bone marrow and secondary lymphoid organs. Despite their apparent longevity in patients, in vitro CLL leukemic B cells rapidly undergo spontaneous apoptosis. The selective survival advantage is due both to intrinsic defects on apoptosis mechanism and to signals delivered by accessory cells at the active site of the disease. Previous studies demonstrated that mesenchymal stromal cells (MSCs), derived from bone marrow, and CD68+ nurse-like cells, derived from peripheral blood, are involved in CLL clone longevity and migration, suggesting a crucial role of MSCs on favouring disease progression. Therefore, in this thesis we evaluated the effect of MSCs, the main stromal population in the bone marrow of CLL patients, on the survival of leukemic B cells and their role in drug resistance. MSCs were isolated from the bone marrow of 46 CLL patients; their immunophenotypic characterization was based on the expression of CD105, CD73 and CD90 and the negativity of CD14, CD34, CD45 and CD31. Co-culturing MSCs and CLL B cells, we confirmed that MSCs are able to support malignant B cell survival, providing an in vitro culture system that closely approximates CLL microenvironment in vivo. We observed that different leukemic clones demonstrated a large variety in the pro-survival effect. Evaluating the cleavage pattern of PARP, we revealed two subsets of CLL clones with different sensitivity to MSCs pro-survival signals. Our results indicate that both cell-cell contact and soluble molecules are actors in the relationship between malignant B cells and the MSCs, promoting CLL B cell survival and migration. Later, we evaluated the role of the MSCs on CLL B cells during the most common cytotoxic therapy used in clinical practice. Our data demonstrate that MSCs are able to protect leukemic B cells from apoptosis during Fludarabine and Cyclophosphamide treatment, both in vitro and in vivo. We tested MSCs protective role also during CLL B cells treatment with Ibrutinib, a novel inhibitor of Btk involved in the BCR signaling pathway, and we found that the treatment counteracts the MSC pro-survival effect. To better understand the effect of Ibrutinib on the cross-talk between CLL B cells and MSCs, we evaluated its role on leukemic B cell migration, also analyzing the expression levels of CCR7 and CXCR4, two chemokine receptors that are central in the homing of the neoplastic clone. We demonstrated that malignant B cell migration is not significantly affected by the Btk inhibitor; since cell-cell contact with MSC is crucial for CLL B cell survival, we analyzed the adhesion of leukemic B cells to MSCs after treatment with Ibrutinib. We found a significant reduction in leukemic B cells and MSCs interactions mediated by the CD49d integrin. In this thesis, we demonstrate that MSCs enhance the survival of leukemic B cells through the release of soluble factors and cell-cell direct contact and that each CLL clone reveals a peculiar response to the anti-apoptotic signals delivered by MSCs. These observations could be relevant to identify patients more responsive to druggable targets on marrow microenvironment and also to find putative new strategies for CLL therapy. A better understanding on the complexity of the cross-talk between CLL cells and their microenvironment during CLL therapy could also help to define mechanisms of drug resistance and treatment failure, as well to plan randomized clinical trials comparing new compounds and their combinations with standard chemo-immunotherapy.

La Leucemia Linfatica Cronica (LLC) è considerate la più comune leucemia del mondo occidentale, rappresentando circa il 30% delle leucemie dell’adulto, ed è caratterizzata dalla proliferazione clonale e dall’accumulo nel sangue periferico, nel midollo osseo e negli organi linfatici secondari di linfociti B maturi CD19+/CD5+/CD23+. Nonostante i linfociti B leucemici mostrino un’aumentata sopravvivenza nei pazienti affetti da LLC, in vitro vanno rapidamente incontro ad apoptosi. Il vantaggio sulla sopravvivenza è legato sia a difetti intrinseci del meccanismo di apoptosi sia a segnali forniti da cellule accessorie, presenti nel sito attivo della malattia. Precedenti studi hanno dimostrato che le cellule mesenchimali stromali (MSC) e le cellule accessorie (“nurse-like”) derivate rispettivamente dal midollo osseo e dal sangue periferico, sono coinvolte nell’aumentata longevità e mobilità del clone leucemico, suggerendo un ruolo cruciale delle MSC nel favorire la progressione della malattia. In questa tesi abbiamo valutato l’effetto delle MSC, la principale popolazione stromale nel midollo osseo dei pazienti affetti da LLC, sulla sopravvivenza dei linfociti B neoplastici e il loro ruolo sulla resistenza ai farmaci. Le MSC sono state isolate da campioni di sangue midollare provenienti da 46 pazienti affetti da LLC; la loro caratterizzazione immunofenotipica è stata effettuata sulla base dell’espressione di CD105, CD73 e CD90 e sulla negatività di CD14, CD34, CD45 e CD31. Allestendo co-colture di MSC e linfociti B leucemici, abbiamo confermato la capacità delle MSC di incrementare la sopravvivenza delle cellule B neoplastiche, fornendo un sistema di coltura in vitro che mima profondamente il microambiente della LLC in vivo. Abbiamo osservato una grande varietà sulla vitalità dimostrata dai diversi cloni leucemici e, mediante la valutazione del frammento clivato della proteina PARP, abbiamo identificato due differenti gruppi di cloni di LLC, con una diversa sensibilità ai segnali di stimolo provenienti dalle MSC. I nostri risultati indicano che sia il diretto contatto cellula-cellula che la presenza di molecole solubili sono coinvolte nell’interazione tra le cellule B leucemiche e le MSC, promuovendo la sopravvivenza e la migrazione della cellula B leucemica. Successivamente, abbiamo valutato l’effetto delle MSC sui linfociti B neoplastici durante un trattamento chemioterapico di uso comune nella pratica clinica. I nostri dati hanno dimostrato che le MSC sono in grado di proteggere le cellule B leucemiche dall’apoptosi durante il trattamento con Fludarabina e Ciclofosfamide, sia in vitro che in vivo. Abbiamo esaminato il ruolo protettivo delle MSC anche durante il trattamento dei linfociti neoplastici con Ibrutinib, un nuovo inibitore della Btk, una chinasi coinvolta nella cascata del segnale del BCR, e abbiamo dimostrato che il trattamento delle cellule B con Ibrutinib è in grado di contrastare l’effetto anti-apoptotico delle MSC. Per meglio definire l’azione di Ibrutinib nell’interazione tra le cellule B di LLC e le MSC, abbiamo valutato il suo ruolo sulla mobilità dei linfociti B leucemici, analizzando inoltre i livelli di espressione di CCR7 e CXCR4, due recettori chemiochinici fondamentali nella migrazione del clone neoplastico. Abbiamo dimostrato che la migrazione delle cellule B neoplastiche non è significativamente influenzata dall’inibitore del Btk; inoltre, considerando che il diretto contatto cellula-cellula con le MSC è di notevole importanza per la sopravvivenza dei linfociti B leucemici, abbiamo analizzato l’adesione delle cellule B alle MSC dopo il trattamento con Ibrutinib, evidenziando che la loro adesione era significativamente ridotta. In questa tesi abbiamo dimostrato che le MSC incrementano la sopravvivenza delle cellule B neoplastiche attraverso il rilascio di fattori solubili e mediante il diretto contatto cellula-cellula, e che ogni clone leucemico rivela una peculiare risposta ai segnali anti-apoptotici rilasciati dalle MSC. Queste osservazioni potrebbero essere determinanti al fine di identificare i pazienti più sensibili a trattamenti mirati a colpire il microambiente midollare ed a trovare potenziali nuove strategie terapeutiche per la LLC. Una migliore comprensione della complessità delle interazioni tra i linfociti leucemici e il loro microambiente nel corso del trattamento potrà inoltre aiutare a chiarire i meccanismi di chemioresistenza e refrattarietà, così come a pianificare studi clinici randomizzati che confrontino nuovi farmaci e la loro combinazione con i trattamenti chemio-immunoterapici già in uso.