Sublethal Effects of Some Veterinary Antibacterials on Freshwater Organisms

The problem of the presence of pharmaceuticals in the environment and of their possible effects on ecosystems has been evidenced only in the last two decades, thanks to the progresses in analytical chemistry, and also to the progressive refinement of toxicological bioassays, leading to the detection of more subtle effects of pharmaceuticals on model organisms. In the last decade, progresses have been made also from the legislative point of view, introducing the duty of accurate evaluation of environmental impact for all newly commercialized drugs. Nevertheless, there is still a lack of knowledge about the environmental effects of pharmaceuticals. In the veterinary field, there are particular concerns about the environmental impact of livestock mass treatments (prophylactic/metaphylactic) which are administered for some days, at full dose and to a wide number of animals. Consequently, large quantities of active substances are released into the environment. Aim of this thesis, presented as a collection paper, was the evaluation of some sublethal effects of antibacterials, employed in mass treatments, on freshwater organisms. This in order to obtain a more in depth picture of the risks they could pose to the aquatic environment. The sensitivity of Daphnia curvirostris and Daphnia magna toward 10 antibacterials [enrofloxacin (EFX), ciprofloxacin(CPX), sulfaguanidine (SGD), sulfadiazine (SDZ), sulfamethazine (SMZ), sulfaquinoxaline (SQO), sulfaclozine (SCZ), sulfamerazine (SMA), sulfadimethoxine (SDM) and trimethoprim (TMP)] and some of their binary mixtures, was compared. Furthermore, a tentative prolonged-toxicity test (lasting 13 days) was settled up in order to evidence toxic responses with drug concentrations that were uneffective in the classic 48h immobilization test. Results showed that D.curvirostris was more sensitive than D.magna to the majority of compounds (7 out of 10). Lowest 48h EC50s were obtained with EFX (4.3 mg L-1 in D.curvirostris) and SGD (6.2 mg L-1 in D.magna). The toxicity of paired compounds was always additive or less than additive. In the prolonged-toxicity test mortality and/or reproduction inhibition were constantly observed. It was concluded that: (1) D.curvirostris could be a suitable model for the evaluation of acute toxicity of antibacterials; (2) the toxicity of EFX and SGD should be given special attention (3) the concentration addition is usually a reasonable worst case estimation of the environmental impact of antibacterial mixtures. Some veterinary antibacterials which may contaminate the aquatic environment due to their use in livestock and/or aquaculture mass treatments were evaluated for their effects on swimming activity in D.magna (primary consumer) and Poecilia reticulata (secondary consumer). Results showed that the chosen endpoint may call to the attention of ecotoxicology some compounds otherwise negligible, based on lethality test. Sublethal effects of TMP were then evaluated in four freshwater organisms: Pseudokirchneriella subcapitata and Lemna minor (growth inhibition), D.magna (reproduction and growth inhibition) and P.reticulata (swimming activity inhibition). TMP showed varying levels of toxicity in the four test performed, with NOEC for the various endpoints in the range of 3.12 to 25 mg L-1. The compound was active on P. reticulata at concentration ≥50 mg L-1 causing inhibition of swimming activity. L. minor was more sensitive than unicellular algae to TMP, with a NOEC of 12.5 mg L-1. The lowest NOEC (3.12 mg L-1) was obtained in D. magna reproduction test and then a Risk Quotient of <0.03 was calculated by comparing the PNEC (31.2 μg L-1) and the TMP concentrations usually detected in freshwater (<1 μg L-1). It was concluded that while TMP concentrations normally detected in surface water are below those able to evoke appreciable biological effects in the various aquatic organisms, TMP concentrations in aquaculture and hospital effluents can be one to three orders of magnitude higher. Furthermore, the co-occurrence and additive effects of other antifolic agents should be taken into account for a cautious risk assessment of the drug. 2 Multigenerational tests on D.magna were performed exposing two subsequent generation of the crustacean to EFX, his metabolite CPX and TMP. In F1 with respect to F0, both for growth and reproduction, a worsening trend of the response with EFX, a similar response with CPX and an attenuating trend with TMP was observed. Furthermore, the lowest EC20 for reproduction inhibition (1.27 mg L-1) was calculated for F1 exposed to EFX. However, other experimentations, longer and more complex, are necessary in order to confirm that EFX is more hazardous to daphnids than CPX and TMP. EC50s measured for the three assayed antibacterials were in the 6.49-36.53 mg L-1 range and therefore environmental unrealistic, except in case of exceptional contaminations that may occur in relation to poorly controlled wastewaters from pharmaceutical factories or excessive use of prophylactic treatments in aquaculture

La presenza di molecole farmacologicamente attive nell’ambiente è un problema che è stato sollevato solamente negli ultimi due decenni grazie, da un lato, all’affinamento delle tecniche analitiche e, dall’atro, alla messa a punto di bioassay sempre più sensibili. Nell’ultimo decennio inoltre, sono stati fatti notevoli passi avanti anche dal punto di vista normativo introducendo l’obbligo di un’accurata valutazione dell’impatto ambientale per tutti i nuovi principi attivi immessi in commercio. Tuttavia le conoscenze relative agli effetti dei farmaci nell’ambiente sono ancora piuttosto limitate. In campo veterinario particolare preoccupazione in relazione alla sicurezza ambientale destano i trattamenti di massa che vengono effettuati a scopo profilattico/metafilattico coinvolgendo un gran numero di animali che vengono trattati a dose piena per alcuni giorni con conseguente notevole rilascio di principi attivi nel suolo o nelle acque. Lo scopo di questa tesi, presentata sottoforma di collection paper, è stato quello di indagare alcuni effetti subletali di antibatterici, impiegati nei trattamenti di massa, su organismi acquatici, al fine di giungere ad una valutazione più accurata dei rischi che questi contaminanti possono comportare per il comparto dulciacquicolo. La sensibilità di Daphnia curvirostris e Daphnia magna è stata confrontata attraverso l’impiego di 10 antibatterici [enrofloxacina (EFX), ciprofloxacina (CPX), sulfaguanidina (SGD), sulfadiazina (SDZ), sulfametazina (SMZ), sulfachinossalina (SQO), sulfaclozina (SCZ), sulfamerazina (SMA), sulfadimetossina (SDM) e trimetoprim (TMP)] e di alcune loro miscele binarie. Inoltre, è stato condotto un test preliminare di tossicità prolungata (della durata di 13 gg), al fine di evidenziare effetti a concentrazioni che non avevano prodotto risposte a 48h col classico test di immobilizzazione. I risultati hanno permesso di osservare che D.curvirostris è più sensibile di D.magna alla maggior parte dei composti (7 su 10). Le più basse EC50 sono state ottenute con EFX (4.3 mg L-1 in D.curvirostris) e SGD (6.2 mg L-1 in D.magna). La tossicità delle miscele binarie è stata sempre additiva o sub additiva e i test prolungati hanno permesso di osservare in tutti i casi mortalità e/o inibizione della riproduzione. Si è concluso che: (1) D.curvirostris può essere un modello adatto per la valutazione della tossicità degli antibatterici; (2) particolare attenzione dovrebbe essere prestata alla tossicità di EFX e SGD; (3) generalmente il concetto di semplice additività è una stima cautelativa dell’impatto ambientale delle miscele di antibatterici. Sono stati valutati gli effetti di alcuni antibatterici sull’attività natatoria di D.magna e Poecilia reticulata. I risultati hanno permesso di osservare che l’end-point selezionato, a differenza dei test di letalità, consente di richiamare l’attenzione sulla tossicità ambientale di alcuni composti. Alcuni effetti subletali del TMP sono stati misurati in quattro organismi d’acqua dolce: Pseudokirchneriella subcapitata and Lemna minor (inibizione dell’accrescimento), D.magna (inibizione della riproduzione e della crescita) e P.reticulata (inibizione dell’attività natatoria). Il TMP ha mostrato diversi livelli di tossicità nei diversi organismi con NOEC che variavano da 3,12 a 25 mg L-1. Il composto era attivo su P.reticulata alla concentrazione ≥50 mg L-1 provocando un’inibizione dell’attività natatoria. La NOEC più bassa (3,12 mg L-1) è stata ottenuta nel test d’inibizione della riproduzione con D. magna, quindi, il confronto tra la PNEC (31,2 μg L) e le concentrazioni normalmente ritrovate nelle acque dolci (<1 μg L-1) ha permesso di calcolare un quoziente di rischio <0,03. Si è concluso che mentre le concentrazioni di TMP normalmente rilevate nelle acque superficiali non sarebbero in grado di provocare effetti biologici apprezzabili nei vari organismi acquatici, le concentrazioni di TMP impiegate in acquacoltura e ritrovate negli scarichi ospedalieri possono raggiungere livelli sino a tre ordini di grandezza superiori. Inoltre per un’analisi del rischio sufficientemente cautelativa la copresenza di TMP ed altri antifolici ed i possibili, conseguenti, effetti additivi dovrebbero essere tenuti in considerazione. Test multi generazionali sono stati effettuati su D.magna esponendo due generazioni consecutive a EFX, al suo metabolita CPX ed a TMP. In F1 rispetto ad F0 è stato osservato, sia sull’accrescimento che sulla riproduzione: un peggioramento degli effetti con EFX, risposte simili 4 con CPX, un’attenuazione degli effetti con TMP. Inoltre, l’ EC20 più bassa, relativa all’inibizione della riproduzione, è stata determinata per gli F1 esposti a EFX; tuttavia, disegni sperimentali più lunghi e complessi si rendono necessari al fine di confermare la maggior pericolosità, per i daphnidi, di EFX rispetto a CPX e TMP. Le EC50 misurate nei tre test variavano da 6,49 a 36,53 mg L-1 e sono, dunque, da considerarsi irrealistiche dal punto di vista ambientale salvo casi eccezionali di contaminazione che si possono verificare in occasione di scarso controllo dei reflui provenienti da stabilimenti farmaceutici o in relazione all’abuso di trattamenti profilattici in acquacoltura