Examining the influence of the endogenous small RNAs on gene expression and genome stability in the maize leaf

Small non-coding RNAs are widespread in all kingdoms of life (Michaux et al. 2014) where they participate in RNA-mediated silencing pathways to regulate and fine-tune gene expression, through transcriptional gene silencing (TGS) and post-transcriptional gene silencing (PTGS) mechanisms. Not all mechanisms of RNA interference (RNAi) are conserved among organisms, which is true for example for the TGS pathway termed RNA-directed DNA methylation (RdDM). RdDM occurs in the nucleus to repress target genes at the transcriptional level, it is an epigenetic pathway because it does not alter the DNA sequence but instead causes gene expression variation by small RNA-guided modifications of chromatin, for example cytosine methylation and histone modifications. In plants RdDM is unique among small RNA-mediated chromatin modifications because it depends on two plant-specific RNA polymerase enzymes called Pol IV and Pol V (Matzke and Mosher 2014). This increases the complexity of RNAi mechanisms in plants, which have been investigated for a large amount of studies in the model species Arabidopsis thaliana (hereafter referred to as Arabidopsis). Small RNAs (sRNAs) and RNAi mechanisms play fundamental roles in many biological processes; in particular, their observed participation in the phenomena of hybrid vigor, stress-response and formation of epialleles makes them an important source of growth in crop production. Arabidopsis shows many differences in genome size, structure and dynamics compared to crops, therefore it is necessary, and challenging, to transfer the knowledge acquired in this model plant to crop species (Mirouze and Vitte 2014). Maize is one of the most important food and feed crops in the world and has a wide range of industrial applications as well. The maize genome has unique characteristics, such as the unusual number of well-characterized active transposable elements (Lisch D 2012), which are the main targets of RdDM. For these reasons it is of particular importance the research aimed to expand our knowledge on how sRNAs control genome activity in maize. This is the general background to this PhD project, whose aim was to characterize the endogenous sRNA population of maize leaf in terms of genomic annotation and abundance, to further examine its influence on gene expression and its response to abiotic stresses. To analyse the sRNA control of gene expression, in addition to wild type maize plants, the rmr6-1 mutant was also studied: impaired in Pol IV function this mutant is characterized by the absence of siRNAs participating in RdDM that require Pol IV for their biogenesis (Erhard et al. 2009). The absence of Pol IV-dependent siRNAs allowed testing what was their impact on genome stability. The sRNA population was characterized through the analysis of sRNA-seq data obtained from our samples. Gene annotation and expression level in wt and mutant plants was retrieved from the analysis of total RNA-seq data obtained by our laboratory from the same samples. To assess the role of sRNAs in stress response we examined the sRNA population of wild type and rmr6-1 mutant plants subjected to abiotic stresses. The abiotic stresses studied were field-mimicked conditions of drought, salinity and the combination of the two, drought plus salinity, because these are the most crucial abiotic stresses that limit the production of the world crops (Munns R 2011). In particular, salinization constitutes a problem also in Mediterranean coastal areas (Flowers TJ 2004) and, considering the region of Veneto, in the coastal soils of the Venice Lagoon (Carbognin and Tosi 2003). The PhD started with the collaborative project between the laboratories of Prof.ssa S. Varotto, Prof. F. Morari and Dr. F. Meggio. The aim of the project was to set up a reproducible protocol for the application of drought and salinity conditions to maize plants that was agronomically realistic and representative of field stress conditions. To mimic field progressive stress conditions, drought, salinity and the combination of the two, drought plus salinity, were applied to plants progressively for ten days and the stress response was evaluated at different time points during the stress application. In field conditions after a period of stress, environmental conditions usually turn more favourable, therefore after ten days of treatment the stresses were removed and plants were grown in optimal conditions to test their recovery capacity. Two different lines were studied: the stress-sensitive inbred line B73 and a stress-resistant F1 commercial hybrid. At the time points of stress application and recovery from the stress, plants responses were analysed with agronomic, physiological and genetic parameters. Agronomic parameters were evaluated by the laboratory of Prof. F. Morari and physiological parameters by Dr. F. Meggio. Our collaboration consisted in the study of the genetic responses of plants. In particular, literature was investigated to identify a set of genes known to be differentially expressed (DE) by stress or belonging to the main pathways involved in abiotic stress response and their transcript level was analysed in our experiment using real time quantitative PCR (qRT-PCR). All the analysed parameters confirmed that the applied treatments were effective in inducing a stress condition in plants. Therefore our stress protocol represents a valid tool for further studies concerning the stress response in maize, which retain their value under field conditions, thus increasing the result translatability for crop improvement. The combination of the examined agronomic, physiological and genetic parameters allowed gaining insights into the mechanisms regulating the different tolerance to the stress of the stress-sensitive and stress-resistant lines. The main work of the PhD project was dedicated to the analysis of sRNA-seq data obtained from wt and rmr6-1 mutant plants, to characterize the endogenous sRNA population of the maize leaf and investigate its effect on gene expression and its stress response. 48 sRNA-seq libraries were sequenced from leaf samples of wt and mutant plants, in control conditions or subjected to abiotic stresses and after the recovery from the stresses. Reads from each library were pre-processed and the quality of the clean reads was verified. Reads were then mapped to the reference maize B73 genome, revealing the typical maize sRNA population profile with the highest abundance of 24-nt sRNAs, followed by the 22-nt and the 21-nt sRNAs. The bioinformatics tools ShortStack was used to de novo identify the maize genome loci responsible for a significant production of sRNAs in the leaf, starting from the merged set of sRNAs of the 48 samples. The identified MIRNA loci were examined first. We found differences between our microRNA annotation and that reported in miRBase that might reflect inaccurate annotation in miRBase or leaf-specific differences in MIRNA processing patterns. The prediction of the microRNA targets was performed on the transcripts annotated in the transcriptome assembly reconstructed from RNA-seq. This allowed identifying a newly annotated transcript as target of a conserved microRNA, helping elucidating the role of this microRNA in maize. Putative novel microRNAs were identified: a number of them had characteristics of bona fide microRNAs while others appeared to be new 'proto-miRNAs' or instead siRNAs. The other identified sRNA loci categories were analysed in terms of co-occupancy with protein-coding genes, transposon and long non-coding RNA (lncRNA) transcripts. A significant enrichment of the loci predominated by the production of 24-nt sRNAs was found in the flanking regions of all the analysed set of genes. In particular, expressed genes were flanked by sRNA loci of 24-nt size class with higher frequencies compared to the non-expressed genes. In the rmr6-1 mutant, despite the dramatic loss of siRNAs observed mainly in gene flanking regions, the number of DE genes compared to wt was 1013 and the downregulation of an sRNA locus was not generally sufficient not even necessary to predict the up or downregulation of its close gene. Therefore, the absence of siRNAs had little impact on the genome stability of the maize leaf, indeed leaves of mutant plants did not have morphological defects and were identical to those of wt plants. The mechanisms that maintain gene silencing when siRNAs are lost and thus RdDM control of gene expression is impaired still remains to be elucidated. Literature data show evidences that the RdDM pathway might be essential to ensure the transgenerational transmission of the epigenetic information. In this hypothesis, to elucidate the role of siRNAs in the control of gene expression it would be helpful to study the activity of siRNAs and the effects of RdDM mutations in other cell types such as the gametes. Alternatively, it would be helpful to study epigenetic changes of gene expression in multiple generations of plants. The absence of siRNAs, although it was not found to compromise the genome stability in the leaf, did have some effects on gene expression that appeared to be secondary effects of the mutation. In particular, in the rmr6-1 mutant it was registered the upregulation of stress-responsive genes and cytochromes and the downregulation of genes involved in the regulation of cell cycle and genes encoding core histone proteins. Finally, the sRNA stress response was examined. We applied the stress protocol previously set up and found a few numbers of miRNAs and sRNA loci of the other categories that were DE in stress conditions. Although the DE sRNAs were less numerous compared to previous works assessing the sRNA stress response in crops, they might be better candidates for stress-tolerance studies because they were found to be DE during stresses mimicking field conditions. Published works cited here are reported in the ‘References’ section of Chapter 2

I piccoli RNA non codificanti sono stati riscontrati in tutti i regni della vita (Michaux et al. 2014). Essi partecipano ai meccanismi di regolazione genica di silenziamento del DNA mediato da RNA, che si distinguono in meccanismi di silenziamento genico trascrizionale (TGS) e post-trascrizionale (PTGS). Non tutti questi pathway sono conservati negli organismi, come ad esempio il meccanismo chiamato di metilazione del DNA RNA-dipendente (in inglese ‘RNA-directed DNA methylation’, RdDM). Esso avviene nel nucleo, dove induce la repressione delle sequenze target a livello trascrizionale. Il pathway RdDM è un esempio di meccanismo epigenetico di controllo dell’espressione genica, in quanto la variazione di espressione viene indotta senza alterazioni di sequenza del DNA, attraverso modificazioni della cromatina guidate dall’azione dei piccoli RNA, come ad esempio la metilazione delle citosine o le modifiche istoniche. Nelle piante il pathway RdDM prevede l’azione di due RNA polimerasi specifiche del regno vegetale, l’RNA polimerasi IV (Pol IV ) e l’RNA polimerasi V (Pol V) (Matzke and Mosher 2014). La specificità di questi enzimi riservata al regno vegetale è indice che le piante hanno evoluto un livello aggiuntivo di complessità dei meccanismi di silenziamento del DNA RNA-dipendenti, che sono stati studiati soprattutto nella pianta modello Arabidopsis thaliana (abbreviata d’ora in poi con il nome Arabidopsis). I piccoli RNA e i meccanismi di silenziamento del DNA RNA-dipendenti ricoprono ruoli fondamentali in diversi processi biologici. In particolare, il loro coinvolgimento nei fenomeni quali il vigore dell’ibrido, la risposta allo stress e la formazione di epialleli li rende un’importante fonte di studio al fine del miglioramento delle piante da coltivazione. Il genoma della pianta Arabidopsis presenta molteplici differenze in termini di dimensione, struttura ed organizzazione dinamica rispetto ai genomi delle piante da coltivazione. Queste differenze sostanziali rendono necessario, ma anche difficoltoso, il trasferimento delle conoscenze acquisite in Arabidopsis da questa pianta modello alle piante da coltivazione (Mirouze and Vitte 2014). Il mais è una delle più importanti coltivazioni a livello mondiale per la produzione di alimenti e mangimi e viene utilizzato in diverse catene industriali. Il suo genoma possiede caratteristiche uniche, come ad esempio la presenza di un inusuale elevato numero di elementi trasponibili attivi (Lisch D 2012), che sono i principali target del pathway RdDM. Per queste ragioni è di particolare importanza la ricerca scientifica volta ad aumentare la conoscenza dei meccanismi di controllo dell’attività del genoma di mais guidati dai piccoli RNA. L’attività del progetto di Dottorato si inserisce all’interno di questo quadro di ricerca. Il principale scopo del progetto è stato la caratterizzazione della popolazione di piccoli RNA endogeni in foglia di mais, in termini di annotazione genomica e abbondanza, che ha permesso poi di valutare gli effetti dei piccoli RNA sull’espressione genica e la loro risposta a stress abiotici. Al fine di indagare il controllo esercitato dai piccoli RNA sull’espressione genica sono state studiate due linee di mais, la linea inbred B73 e il mutante rmr6-1. Questo mutante presenta una forma non funzionale della Pol IV che provoca la mancata produzione dei piccoli RNA che partecipano al pathway RdDM e che dipendono dalla Pol IV per la loro biogenesi, i quali sono chiamati siRNA, dall’inglese ‘small interfering RNA’ (Erhard et al. 2009). L’assenza dei siRNA ha permesso di valutarne gli effetti sulla stabilità del genoma. La popolazione dei piccoli RNA è stata caratterizzata attraverso l’analisi di dati di sequenziamento di piccoli RNA ottenuti dai nostri campioni. L’annotazione dei geni e i loro livelli di espressione sono stati ottenuti nel nostro laboratorio attraverso l’analisi di dati di sequenziamento di RNA totale proveniente dagli stessi campioni. Al fine di valutare il ruolo dei piccoli RNA nella risposta allo stress la loro espressione è stata analizzata in piante wild type e mutanti sottoposte a stress abiotici. I protocolli di stress utilizzati sono stati trattamenti che mimano gli episodi di stress idrico, salino e la combinazione dei due, idrico più salino, che si verificano in condizioni di campo. Sono stati scelti questi stress abiotici in quanto sono le tipologie di stress più frequenti che abbassano le rese della produzione delle piante da coltivazione a livello mondiale (Munns R 2011). In particolare, la salinizzazione costituisce un problema anche nelle zone costiere del Mediterraneo (Flowers TJ 2004) e, a livello della regione Veneto, nei suoli costieri della laguna di Venezia (Carbognin and Tosi 2003). Il lavoro del Dottorato è iniziato con la partecipazione ad un progetto di collaborazione tra i laboratori della Prof.ssa S. Varotto, del Prof. F. Morari e del Dr. F. Meggio. Lo scopo del progetto è stato la messa a punto di un protocollo riproducibile per l’applicazione di stress idrico, salino e idrico più salino in combinazione a piante di mais, che fosse realistico a livello agronomico e quindi simile alle condizioni di stress che avvengono in campo. Al fine di mimare gli episodi stress progressivo che si verificano in campo, gli stress idrico, salino e la loro combinazione sono stati applicati alle piante in modo progressivo per dieci giorni e la risposta delle piante allo stress è stata esaminata in diversi momenti durante la sua applicazione. In condizioni di campo solitamente accade che dopo un episodio di stress le condizioni ambientali tornino favorevoli, quindi dopo i dieci giorni di applicazione di stress quest’ultimo è stato rimosso e le piante sono state cresciute in condizioni ottimali per valutarne la capacità di recupero dallo stress. Due diverse linee di mais sono state esaminate: la linea inbred B73 sensibile agli stress e un ibrido commerciale F1 selezionato per la sua resistenza agli stress. In diversi momenti durante l’applicazione dello stress e poi durante la fase di recupero dallo stress la risposta delle piante è stata valutata attraverso l’analisi di parametri agronomici, fisiologici e genetici. I parametri agronomici sono stati studiati dal laboratorio del Prof. F. Morari e i parametri fisiologici dal Dr. F. Meggio. L’attività svolta nel lavoro di Dottorato ha riguardato lo studio della risposta delle piante a livello genetico. In particolare, sono stati cercati in letteratura geni per i quali fosse nota l’espressione differenziale in seguito agli stress studiati o l’appartenenza alle principali vie molecolari di risposta a stress abiotici. Il loro livello di espressione è stato studiato nei nostri campioni attraverso la tecnica della PCR quantitativa in real-time. Tutti i parametri analizzati hanno confermato che i trattamenti sono stati efficaci nell’indurre la condizione di stress nelle piante. Di conseguenza, il protocollo messo a punto costituisce un valido strumento per studi successivi riguardanti la risposta di piante di mais a questi stress, i cui risultati mantengano validità in caso di applicazione in campo agronomico. Lo studio combinato dei parametri agronomici, fisiologici e genetici ha permesso di approfondire i meccanismi che regolano la diversa tolleranza allo stress delle due linee di mais studiate. Il lavoro principale del Dottorato ha riguardato l’analisi bioinformatica di dati di sequenziamento di piccoli RNA, ottenuti da piante wild type e mutanti rmr6-1, con lo scopo di caratterizzare la popolazione dei piccoli RNA endogeni della foglia di mais, esaminarne gli effetti sull’espressione genica e la risposta a stress abiotici. 48 librerie di piccoli RNA sono state sequenziate da campioni di foglia di piante wild type e mutanti, cresciute in condizioni di controllo, in condizioni di stress abiotici e di recupero dallo stress. Le sequenze ottenute sono state pre-processate e la loro qualità è stata inizialmente verificata. Dopodiché esse sono state allineate al genoma di B73 e le sequenze allineate hanno mostrato il tipico profilo dei piccoli RNA di mais: i più abbondanti con lunghezza di 24-nt, seguiti da quelli con lunghezza di 22-nt e poi di 21-nt. Il progamma bioinformatico ShortStack è stato utilizzato per identificare de novo i loci genomici responsabili di una produzione significativa di piccoli RNA in foglia di mais, partendo dall’insieme di tutte le sequenze prodotte dai 48 campioni sequenziati. I loci MIRNA identificati sono stati i primi a essere analizzati. Sono state riscontrate delle differenze tra la nostra annotazione prodotta dei microRNA e quella riportata nel database miRBase, le quali potrebbero riflettere un’inaccurata annotazione presente in miRBase o differenze specifiche della foglia nel processamento dei precursori dei microRNA. La predizione dei target dei microRNA è stata eseguita sui trascritti annotati nel trascrittoma di mais ricostruito dai dati di sequenziamento di RNA totale. Un trascritto nuovo annotato è stato predetto come target di un microRNA di mais che è conservato in diverse specie vegetali, aiutando a capire la funzione di questo microRNA in mais. Nuovi putativi microRNA sono stati identificati: una parte di essi ha presentato le caratteristiche per essere considerati microRNA bona fide, invece altri hanno presentato caratteristiche tipiche dei 'proto-miRNA' o dei siRNA. Le altre categorie identificate di loci di piccoli RNA sono state analizzate in termini di co-occupancy con i geni codificanti proteine, con i trascritti di trasposoni e con i lunghi RNA non codificanti (lncRNA). I loci con produzione primaria di piccoli RNA di 24-nt di lunghezza sono stati trovati significativamente arricchiti nelle regioni fiancheggianti di tutte e tre le tipologie di geni considerate. In particolare, i geni espressi hanno mostrato una maggiore probabilità di essere fiancheggiati da loci di piccoli RNA di lunghezza di 24-nt rispetto ai geni non espressi. Nel mutante rmr6-1, nonostante la perdita sostanziale dei siRNA osservata soprattutto nelle regioni fiancheggianti dei geni, un totale di 1013 geni sono stati trovati differenzialmente espressi (DE) rispetto al wild type e la downregolazione di un locus di piccoli RNA non è risultato in generale un criterio sufficiente e nemmeno necessario per predire la up o downregolazione del suo gene vicino. Di conseguenza, l’assenza dei siRNA non ha mostrato avere un grosso impatto nella stabilità del genoma in foglia di mais, infatti, le foglie del mutante non hanno evidenziato difetti morfologici e sono state osservate essere identiche a quelle delle piante wild type. I meccanismi coinvolti nel mantenimento del silenziamento genico quando i siRNA non sono presenti e il pathway RdDM è alterato nella sua funzione rimangono ancora sconosciuti. Dati di letteratura evidenziano la possibilità che il pathway RdDM sia essenziale per garantire la trasmissione transgenerazionale dell’informazione epigenetica. In questa ipotesi, al fine di approfondire il ruolo dei siRNA nel controllo dell’espressione genica, risulterebbe informativo lo studio dell’attività dei siRNA e delle mutazioni del pathway RdDM in altri tipi cellulari, ad esempio i gameti. Risulterebbe informativo anche lo studio delle variazioni epigenetiche di espressione genica in generazioni successive di piante. La mancanza dei siRNA, nonostante sia stato verificato non compromettere la stabilità del genoma nella foglia, è stato osservato indurre cambiamenti di espressione genica che sono apparsi come effetti secondari della mutazione. In particolare, nel mutante rmr6-1 è stata registrata l’upregolazione di geni di risposta allo stress e di geni codificanti citocromi e la downregolazione di geni coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare e di geni codificanti proteine istoniche. Infine è stata esaminata la risposta allo stress dei piccoli RNA. Sono stati applicati i trattamenti di stress precedentemente messi a punto ed è stato identificato un piccolo numero di microRNA e loci di piccoli RNA delle altre categorie differenzialmente espressi in condizioni di stress. Nonostante questo numero sia risultato inferiore rispetto a quello trovato in precedenti lavori che hanno analizzato la risposta dei piccoli RNA allo stress, i piccoli RNA DE identificati potrebbero essere candidati migliori per studi di tolleranza allo stress, in quanto la loro espressione differenziale è stata indotta da condizioni di stress simili a quelle che si verificano in campo. I lavori qui citati sono riportati nella bibliografia del secondo capitolo di questa tesi