Hereditary Hearing Loss: From Molecular Bases To Phenotypic Caractherization

Hearing loss is one of the most common birth defects in developed countries. Approximately one/two in 1000 newborns are diagnosed with bilateral permanent sensorineural hearing loss. Hereditary hearing loss can be syndromic (about 25%), in which deafness is associated with other signs and/or symptoms, and non-syndromic (about 75%), in which no other clinical features are present. Non-syndromic hearing loss (NSHL) is characterized by a vast genetic heterogeneity with more than 160 loci described in humans and 100 genes so far identified. NSHL generally follows simple Mendelian inheritance and is predominantly transmitted as an autosomal recessive trait (75-80%), although other modes of inheritance are possible: autosomal dominant (20%), X-linked (2-5%) and mitochondrial (1%). Given the high genetic heterogeneity of HL, tests based on NGS technologies are rapidly replacing many single-gene Sanger sequencing tests, due to their technical limits and higher costs. The aim of this work was translational, with the goal to develop advanced molecular tools, with high diagnostic rate, and to investigate the genetic bases of NSHL in a population of Caucasian individuals, mainly of pediatric age. A customized NGS targeted panel of 59 genes, strongly associated, in Caucasians, with NSHL or with SHL, which onset is usually characterized by isolated deafness (i.e. Pendred and Usher syndrome), was designed and developed. The Ion Torrent PGMTM platform and a customized bioinformatics pipeline have been used for the analysis of DNA samples collected from clinically highly selected subjects with a previous negative test for the frequently mutated GJB2 gene. A series of 78 cases has undergone a complete study; an etiological diagnosis has been established for 34 of these subjects, with an overall diagnostic yield of 43.6%. For each tested subject, an average depth of coverage of 249 X in the analyzed sequences and a mean of 499 variants were obtained. Likely causative identified variants were located in the following 20 genes: CDH23, GJB2, COCH, MYO7A, ADGRV1, EYA4, OTOG, SLC17A8, TMPRSS3, ACTG1, CEACAM16, COL11A2, GJB3, KCNQ4, MYH9, MYO6, PTPRQ, SLC26A4, STRC, TMC1. The most frequently mutated gene in our cohort was CDH23, which, even in our cases, accounted both for NSHL and Usher syndrome type 1 phenotypes. A novel EYA4 mutation, identified in two related subjects with post-lingual progressive deafness, was found to co-segregate in two individuals of the same family, with a Waardenburg syndrome phenotype, due to a novel PAX3 gene mutation. All the identified variants were collected in an in-house database that proved an invaluable tool for the identification of recurrent variants or possible alignment errors, and for further stratification and correlation between genotype and phenotype. In conclusion, the targeted gene-panel we have developed, in combination with the in-house bioinformatics pipeline, is a proven sensitive diagnostic tool capable of providing an extremely competitive diagnostic yield. Our work further demonstrates the importance of integrating the power of NGS technology and data process with the fundamental role of a strong clinical evaluation in keeping with what is expected from modern medicine.

Nei paesi sviluppati, l’ipoacusia rappresenta uno dei principali deficit presenti alla nascita; circa 1/2 su 1000 neonati vengono diagnosticati con una perdita uditiva neurosensoriale bilaterale permanente. L’ipoacusia ereditaria può essere sindromica, in circa il 25% dei casi, in cui la sordità è associata ad altri segni e/o sintomi e non sindromica (circa il 75%), in cui non sono presenti altre caratteristiche cliniche. L’ipoacusia neurosensoriale non sindromica è caratterizzata da una vasta eterogeneità genetica con più di 160 loci descritti nell'uomo e circa 100 geni finora identificati. Tale ipoacusia viene prevalentemente ereditata in modo autosomico recessivo (75-80%), poi autosomico dominante (20%) e in rari casi è ereditata per via X-linked (2-5%) o mitocondriale (1%). Considerando l'elevata eterogeneità dei geni associati ad ipoacusia, le tecnologie NGS stanno rapidamente sostituendo il sequenziamento Sanger su singolo gene, a causa dei limiti tecnici e dei costi di quest’ultimo. Lo scopo di questo lavoro è stato traslazionale, ovvero sviluppare uno strumento molecolare avanzato, con un elevato rate diagnostico, per indagare le basi genetiche dell’ipoacusia non sindromica in una popolazione di individui caucasici, soprattutto di età pediatrica. Allo scopo, è stato quindi disegnato un pannello genico comprendente 59 geni fortemente associati, nei Caucasici, ad ipoacusia non sindromica o ad ipoacusia sindromica, in particolare includendo quelle condizioni in cui la sordità insorge prima degli altri sintomi, come apparentemente isolata (sindrome di Pendred e sindrome di Usher). L’analisi NGS è stata condotta sulla piattaforma Ion Torrent PGMTM ed è stata sviluppata una pipeline di analisi dati per ottimizzare la chiamata delle varianti, utilizzando criteri di filtraggio ad hoc. In totale sono stati analizzati 78 soggetti, caratterizzati clinicamente e testati per le mutazioni nel gene GJB2 e le delezioni del gene GJB6, risultando negativi. Per 34 soggetti sui 78 analizzati è stato possibile ottenere una diagnosi molecolare, consentendo una resa diagnostica complessiva del 43,6%. Per ciascun soggetto testato è stata ottenuta una copertura media di 249X e una media di 499 varianti. Le varianti possibilmente causative identificate sono state localizzate nei geni: CDH23, GJB2, COCH, MYO7A, ADGRV1, EYA4, OTOG, SLC17A8, TMPRSS3, ACTG1, CEACAM16, COL11A2, GJB3, KCNQ4, MYH9, MYO6, PTPRQ, SLC26A4, STRC, TMC1. Nella coorte di soggetti analizzati il gene più frequentemente mutato è stato CDH23, identificato sia in soggetti con ipoacusia non sindromica che in un bambino con sindrome di Usher di tipo 1. E’ stata inoltre identificata una nuova mutazione nel gene EYA4, presente in due soggetti correlati con sordità progressiva post-linguale; tale variante è stata trovata anche in altri due soggetti della stessa famiglia, i quali presentavano un fenotipo di sindrome di Waardenburg e nei quali è stata identificata una nuova variante nel gene PAX3. Tutte le varianti identificate sono state raccolte in un database interno, che costituisce uno strumento prezioso per identificare le varianti ricorrenti, eventuali errori di allineamento e per un’ulteriore stratificazione e correlazione tra genotipo e fenotipo. In conclusione, il pannello genico sviluppato, in combinazione con una pipeline bioinformatica ad hoc, si è dimostrato uno strumento diagnostico molto sensibile ed in grado di fornire diagnosi eziologica con una resa diagnostica estremamente competitiva. Questo lavoro dimostra l’importanza di coniugare le nuove potenti tecnologie di analisi genomica NGS e di processamento dei dati con un’accurata caratterizzazione clinica, in linea con le richieste della moderna medicina.