Characterization of molecular pathways involved in acute and acute-on-chronic liver disease

Introduction: Acute decompensation was defined as the acute development of one or more major complications of liver disease and it was the main cause of hospitalization in patients with cirrhosis. The acute-on-chronic liver failure (ACLF) was characterized by acute decompensation of cirrhosis, organ failure and high 28-day mortality. ACLF displayed key features of systemic inflammation and its poor outcome was closely associated with exacerbated systemic inflammatory responses. Inflammasomes were multiprotein complexes which proteolytically activates the cytokines IL-1β and IL-18. These substrates might have an effect on the development of liver disease. Extracellular vesicles (EVs) were involved in many important biological processes as well as in disease pathogenesis. The dynamics of EVs secretion by different cell types and how the secreted EVs interact to advance the pathogenesis of liver disease were still unknown. Aims: The aim of this study was to characterize the molecular pathways involved in acute decompensation of cirrhosis and ACLF through: the characterization of the inflammatory profile of patients, the in vitro evaluation of cytotoxic effects of plasma from patients on renal tubular cells, the expression of Inflammasome in these treated cells and in Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) of patients, the characterization of EVs from patients and the study of in vitro effects of isolated EVs in renal tubular cells. Material and Methods: We enrolled patients with compensated cirrhosis, acute decompensation in cirrhosis, ACLF and healthy subjects as control population. Plasma levels of IL-6, IL-1β and IL-18 were detected by ELISA assay. Cytotoxic effects of plasma on renal tubular cells were assayed by annexin V and propidium iodide kit. Inflammasomes expression was detected both in renal tubular cells treated and in PBMC extracted from patients by Real Time PCR. Plasma EVs were extracted by ultracentrifugation and concentration was measured by Nanosight. Characterization of EVs was performed by FACS analysis. Cytotoxic effects of plasma EVs on renal tubular cells were assayed by XTT assay. Results: Plasma levels of pro-inflammatory cytokines measure in the firsts patients enrolled did not differed between the groups of compensated cirrhosis, acute decompensation and ACLF. Also viability and death rate did not change in a way statistically significant in cell stimulated with plasma from the three groups of patients. Furthermore, Inflammasome gene expression in these cells did not underlines the activation of this protein complex. In PBMC from patients, gene expression of Tool-like receptor 2 (TLR-2) was significantly higher in patients with compensated cirrhosis compare to acute decompensation of cirrhosis (p=0.036). Albumin added to cell medium reduced cytotoxic effects of plasma on renal tubular cells. Plasma EVs of patients enrolled were more concentrated in ACLF groups compare to healthy subjects. EVs did not expressed selected platelets (CD41, CD42b) and monocyte markers (CD14) in their surface but they expressed marker of platelets activated endothelium (CD62E). The levels of CD62E were significantly higher in patients with ACLF compare to healthy subjects and patients with compensated cirrhosis (p=0.0041 and p=0.0111, respectively). CD40L levels were significantly higher in all patients' groups compare to healthy subjects (p<0.02). Plasma EVs from patients with acute and acute-on-chronic liver failure exerted a higher cytotoxic effects compare to healthy subjects and patients with compensated cirrhosis on renal tubular cells (p<0.0001). Cells incubated with EVs from acute and acute-on-chronic liver failure underwent to apoptosis (p<0.0001), to ROS production (p<0.0001), to lose albumin intake capabilities (p<0.0001) and reduction of Zonula Occludens-1 (ZO-1) expression (p=0.0166) compare to healthy subjects and patients with compensated cirrhosis. Instead, megalin and PGC1α expression did not change. Conclusions: The role of EVs in decompensated cirrhosis and ACLF need to be invastigated and study their hypothetic role as vehicle of mediator of extrahepatic organ injury and complications of cirrhosis.

Introduzione: Lo scompenso acuto in cirrosi è definito come la progressione acuta di una o più gravi complicanze della patologia epatica ed è la principale causa di ospedalizzazione nei pazienti con cirrosi. L'insufficienza epatica acuta su cronica (ACLF) è caratterizzata da uno scompenso acuto della cirrosi, da danno d'organo e da un elevato tasso di mortalità a 28 giorni. L'ACLF è caratterizzato da infiammazione sistemica e l'outcome infausto è strettamente associato con l'eccessiva risposta infiammatoria che si attiva nel paziente. L'inflammasoma è un complesso multi-proteico che attiva, mediante taglio proteolitico, citochine pro-infiammatorie come IL-1β e IL-18. Queste, hanno un ruolo nello sviluppo della patologia epatica. Le vescicole extracellulari (EVs) sono coinvolte in molti processi biologici importanti, sia fisiologici che patologici. Il processo di secrezione delle EVs da diversi tipi di cellule e la loro azione nel modulare l'avanzamento della patogenesi nella malattia epatica, non sono ancora completamente chiariti. Scopo: Lo scopo di questo studio è caratterizzare la via del segnale coinvolta nello scompenso acuto della cirrosi e dell'insufficienza epatica acuta-su-cronica attraverso: la caratterizzazione del profilo infiammatorio dei pazienti arruolati, lo studio in vitro dell'effetto citotossico nel plasma dei pazienti nelle cellule tubulari renali (RTC), lo studio dell'espressione dell'inflammasoma nelle cellule trattate e nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) estratte dai pazienti, la caratterizzazione delle EVs estratte dal plasma dei pazienti arruolati e lo studio del loro effetto in vitro su colture di RTC. Materiali e Metodi: sono stati arruolati pazienti con cirrosi compensata, scompenso acuto in cirrosi, insufficienza epatica acuta-su-cronica e una popolazione di volontari sani come controllo. I livelli plasmatici di IL-6, IL-1β e IL-18 sono stati misurati con kit ELISA. L'effetto citotossico del plasma nelle RTC è stato testato con il kit costituito da annexina V e propidio ioduro. Il livello di espressione delle molecole dell'inflammasoma è stato determinato sia nelle cellule stimolate con il plasma, sia nei PBMC estratti dai pazienti, attraverso Real Time Poly Chain Reaction (RT-PCR). Le EVs plasmatiche sono state estratte mediante ultracentrifugazione e la loro concentrazione determinata con il Nanosight. La loro caratterizzazione è stata eseguita mediante analisi al FACS. L'effetto citotossico delle EVs sulle RTC è stato determinato mediante saggio XTT. Risultati: I livelli plasmatici delle citochine pro-infiammatorie, misurati nei primi pazienti arruolati, non mostra differenze tra i gruppi di pazienti con cirrosi compensata, scompensata e insufficienza epatica acuta-su-cronica. Anche la vitalità e la morte cellulare nelle colture stimolate con i plasma dei pazienti arruolati non hanno mostrato un profilo peculiare dei gruppi testati e non è stata riscontrata attivazione della trascrizione delle molecole dell'inflammasoma. L'espressione del Tool-like receptor 2 (TLR-2) nei PBMC si è dimostrata significativamente elevata nei pazienti con cirrosi compensata rispetto a quelli con scompenso acuto (p=0,036). Aggiungendo albumina al mezzo di coltura cellulare si è notata una riduzione dell'effetto citotossico del plasma dei pazienti nelle RTC. La concentrazione plasmatica di EVs risulta maggiore nei pazienti con insufficienza epatica acuta-su-cronica rispetto ai controlli sani. Le vescicole non esprimono i marcatori tipici piastrinici (CD41 e CD42b) e monocitari (CD14) sulla loro superficie ma esprimono il marcatore dell'epitelio attivato da piastrine (CD62E). I livelli di CD62E sono significativamente elevati nei pazienti con insufficienza eparica acuta-su-cronica rispetto ai controlli sani e ai pazienti con cirrosi compensata (p=0,0041 e p=0,0111, rispettivamente). I livelli di CD40L sono significativamente elevati in tutti i gruppi di pazienti rispetto ai controlli sani (p<0,02). Le EVs isolate dei pazienti con insufficienza epatica acuta-su-cronica hanno un effetto citotossico superiore rispetto a quelle dei controlli sani e dei pazienti con cirrosi compensata nelle RTC (p<0,0001). Le cellule incubate con le EVs da pazienti con scompenso acuto in cirrosi e insufficienza epatica acuta-su-cronica vanno incontro ad apoptosi (p<0,0001), a produzione massiccia di ROS (p<0,0001), alla perdita della capacità di internalizzare l'albumina (p<0,0001) e alla riduzione dell'espressione di Zonula Occludens-1 (ZO-1) (p=0,0166) rispetto ai soggetti sani e ai pazienti con cirrosi compensata. Non si osserva invece un cambiamento nell'espressione cellulare di megalina e PGC1α. Conclusioni: Il ruolo delle EVs nella cirrosi scompensata necessita di essere approfondito perché potrebbero rappresentare il veicolo su cui viaggiano i mediatori del danno d’organo extraepatico.