Alfa-sinucleina e membrane: esame dei parametri che influiscono sull' interazione e messa a punto di un sistema membrano mimetico adatto a studi NMR

Human alpha-synuclein is an ubiquitary protein localized mainly in presynaptic terminals and the great scientific interest for studying it is justified by the identification of its aberrant aggregations in several neurodegenerative diseases, among which are Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and Lewy bodies dementia. At physiological conditions, alpha-synuclein adopts a random conformation, but it has been found in a ß-sheet structure in Lewy bodies, of which it is the main constituent. Moreover, the N-terminal region assumes a helical conformation in the presence of SDS micelles or SUVs (small unilamellar vesicles) and, on the basis of this observation, a functional hypothesis was made involving alpha-synuclein in synaptic vesicles recycling. An open question regards some details of this structure: in SDS micelles, all the NMR studies have demonstrated that the N-terminal part is positioned on the micelle surface and at least one flexible stretch is present, from leucine 38 to threonine 44. This is a particular region, because it contains tyrosine 39, a residue that may be oxidised in conditions of oxidative stress, and it was already demonstrated that the oxidised form of the protein has a higher propensity for the aggregation. Possibly, the biological activity of alpha-synuclein entails a similar interaction with cellular membranes, but the helical breaks found in SDS may be due to the reduced dimensions of the micelle, which is not adequate to accommodate a 100-residue-long helix. On the contrary, we believe that these flexible stretches may have a functional role and, in order to investigate structural details of alpha-synuclein in a membrane-mimetic environment, we wanted a membrane-mimetic system different from the classic micelles (to avoid objections concerning the small size and high curvature) and sufficiently small to give visible NMR signals. First of all we investigated some of the variables that could affect the binding of our protein with membranes studying three fragments of alpha-synuclein in the presence of SUVs: 1-99 (Syn99), which represents the whole part of the protein that can interact with membranes and contains all the seven imperfect repeats characterizing the N-terminal sequence of the protein; 1-52 (Syn52), made of four of the quoted repeats; and 57-102 (Syn57-102), containing the NAC (Non-Amyloid-Component) region responsible of the aggregation processes of synuclein. In this case SUVs are a useful membrane-mimetic system, because they resemble synaptic vesicles in the neural cytoplasm where alpha-synuclein usually is, and with such a system we performed several circular dichroism titrations to establish the role of some variables in the protein-membrane interaction, in particular composition, pH, temperature and SUVs size. The data about SUVs size were particularly important for our purposes, because increasing the mean diameter of SUVs is the same as decreasing its surface curvature and the system we wanted to use for our NMR studies was bicelles, a well known useful membrane-mimetic system for NMR studies without any curvature. Since their discovery, bicelles have become a very useful membrane-mimetic system for NMR structural studies in solution, but most of the bicelles described in the literature contain DMPC and DHPC, zwitterionic phospholipids with which our protein cannot interact, so we had to change the bicelles composition. To our knowledge, all the attempts made to prepare bicelles composed exclusively by acidic phospholipids were unsuccessful, and this is what we verified trying to prepare bicelles made of POPS/DHPC mixtures. So the choice was to use DMPG as long-chain phospholipid, that has the same hydrophobic tails of DMPC largely used in literature, but a negatively charged headgroup with which alpha-synuclein can interact. The samples was characterized by TEM and DLS, that revealed an heterogeneity in the size of the objects, but, in the case of the smallest ones, they showed the size and shapes typical of the classical bicelles. We optimized the bicelles preparation protocol and recorded several DOSY experiments at 310 K to evaluate the stability of our first samples: q = 1 bicelles showed a very poor stability of the sample: our hydrodynamic radius went from about 5 nm immediately after the preparation to 40 - 50 nm after 10 hours. Such big objects are useless for NMR purposes, so we reduced the q of our bicelles to 0.5, a value that gives a radius of 6-10 nm, useful for the binding of a 100-residue protein as Syn99 is. Moreover, we tested the stability of bicelles in the presence of buffer systems at different ionic strengths by the same kind of experiments, but we found that any salt content increased the viscosity of the samples, and we decided to work in water. Several different conditions were tested by circular dichroism to maximize the interaction of Syn99 with the bicelles to elucidate the bicelle-bound conformation of alpha-synuclein by NMR, and we found that even in the case of bicelles, the protein showed the classic helix CD spectra and this is the first evidence of synuclein binding to planar double layers. Then we verified that the binding is favoured by low ionic strength and is independent on temperature, and by a CD titration, we set the minimum phospholipids/Syn99 ratio to get the highest helix content. Despite the optimization of the membrane-protein interaction, we couldn't collect any significant NMR spectrum, probably due to the large sizes of the bicelles and to the system instability. We abandoned the attempts to study Syn99 bound to bicelles, and we decided to study the two fragments (Syn52 and Syn57-102) composing the whole N-terminal region of alpha-synuclein. We prepared bicelles with q = 0.4, which are much more stable and smaller than the ones with q = 1.0 in the same conditions, according to our DOSY measurements. We began studying Syn52 using the same conditions as Syn99, which was the right ones also for this fragment. We collected a HSQC spectrum (to our knowledge the first on a bicelle-bound peptide larger than 30 residues) that was compared with the one of the same peptide in SDS and some differences could be observed. We performed and assigned a TOCSY-HSQC and a NOESY-HSQC experiment on the SDS samples and we would like to perform the same kind of experiments on the peptide bound to bicelles to examine the differences in the chemical shifts and to find probable differences in the conformation in the two different situations, with a particular attention for the L38-T44 loop. We tried to repeat the whole procedure to the Syn57-102 fragment, but we did not see any helix conformation by circular dichroism, even changing pH, temperature and DMPG/peptide ratio, consistently with the data collected for the peptide in the presence of large SUVs. We tried to perform a HSQC experiment but in this condition we did not see any signal.

L'alfa-sinucleina è una piccola proteina espressa principalmente ai terminali presinaptici, che è divenuta l'oggetto di numerosi studi da quando sono state identificate alcune sue mutazioni tossiche che portano alla sua aggregazione in diverse patologie neurodegenerative, tra cui la malattia di Parkinson, la malattia di Alzheimer e la demenza con corpi di Lewy. In condizioni fisiologiche l'alfa-sinucleina ha una struttura disordinata, ma nei corpi di Lewy, di cui è il principale costituente, è stata trovata in struttura ß. Inoltre, la sua porzione N-terminale assume una conformazione elicoidale in presenza di micelle di SDS o di SUV (small unilamellar vesicles) e, proprio sulla base di queste osservazioni, è stata fatta un'ipotesi sul ruolo fisiologico della proteina (ancora sconosciuto) che la vedrebbe coinvolta nel processo di riciclo delle vescicole sinaptiche. Alcuni dettagli di questa struttura sono tuttavia ancora controversi: in micelle di SDS, tutti gli studi NMR condotti fino a questo momento concordano nell'affermare che la proteina si trova sulla superficie della micella e la maggior parte di essi afferma che sia presente almeno un loop flessibile nella struttura, tra la leucina 38 e la treonina 44. Questa regione della proteina è molto particolare: contiene, infatti, la tirosina 39, un residuo che in condizioni di stress ossidativo, può essere ossidato, ed è già stato chiarito che la forma ossidata della proteina aggrega più facilmente. Una delle ipotesi strutturali riguarda la possibilità che alfa-sinucleina abbia una simile interazione con le vescicole sinaptiche presenti all'interno dei neuroni, ma l'interruzione dell'elica proposta dagli studi NMR potrebbe essere un artefatto dovuto alle piccole dimensioni delle micelle di SDS, che non sarebbero adatte ad ospitare un'elica di 100 residui. Al contrario, questo loop flessibile potrebbe avere un ruolo funzionale e, proprio per indagare i dettagli strutturali dell'alfa-sinucleina in ambiente membrano-mimetico, ci siamo posti l'obiettivo di trovare un sistema diverso dalle classiche micelle (per evitare le critiche riguardanti la loro piccolo dimensione) ma sufficientemente piccolo da permetterci di ottenere segnali NMR. Per prima cosa abbiamo stabilito quali fossero le variabili che influivano sull'interazione proteina - membrana prendendo in esame tre frammenti della proteina in presenza di SUV: 1-99 (Syn99) che rappresenta tutta la porzione che può interagire con le membrane e contiene le sette ripetizioni imperfette che caratterizzano le porzione N-terminale dell'alfa-sinucleina; 1-52 (Syn52), costituito da quattro di tali ripetizioni; e 57-102 (Syn57-102) che contiene il frammento NAC (Non-Amyloid-Component) responsabile del processo di aggregazione della proteina. In questo caso le SUV sono un ottimo sistema membrano-mimetico, perché assomigliano alle vescicole sinaptiche presenti nel citoplasma neuronale con cui la proteina può interagire e svolgere la sua funzione fisiologica, ed è su questo tipo di sistema che abbiamo condotto alcune titolazioni al dicroismo per verificare il ruolo di alcuni parametri sulla capacità di strutturarsi dell'alfa-sinucleina, in particolare composizione, pH, temperatura e dimensione delle vescicole. Soprattutto i dati riguardanti l'effetto della dimensione sono stati particolarmente importanti e utili per i nostri scopi, perché aumentare il diametro delle SUV equivale a diminuire la curvatura sulla loro superficie e il sistema che volevamo usare per gli studi NMR è costituito dalle bicelle che non hanno alcuna curvatura. Fin dalla loro scoperta sono diventate un sistema membrano-mimetico molto usato per studi strutturali in soluzione, ma la maggior parte delle bicelle usate in letteratura sono composte da DMPC e DHPC, due fosfolipidi zwitterionici con cui la nostra proteina non è in grado di interagire, perciò abbiamo dovuto cambiare la composizione delle bicelle utilizzate. Per quanto ne sappiamo, tutti i tentativi fatti fino ad ora per preparare bicelle composte solo da fosfolipidi acidi non sono mai andati a buon fine, difficoltà che abbiamo riscontrato anche noi durante i tentativi di preparare bicelle costituite da POPS e DHPC. Per questo motivo la scelta dei fosfolipidi acidi è caduta su DMPG come fosfolipide a catena lunga, che ha la stessa porzione idrofobica di DMPC largamente usato in letteratura, am una testa polare carica negativamente a pH fisiologico che può permettere l'interazione con l'alfa-sinucleina. I campioni caratterizzati tramite TEM e DLS hanno mostrato un'eterogeneità  nelle dimensioni degli oggetti, ma, almeno per quanto riguarda i più piccoli, hanno la dimensione e la forma tipiche delle classiche bicelle. Abbiamo ottimizzato il protocollo di preparazione delle bicelle e raccolto diversi esperimenti DOSY a 37 °C per valutare la stabilità  delle bicelle aventi q = 1, che però si sono rivelate molto instabili. Il raggio idrodinamico misurato immediatamente dopo la preparazione era di circa 5 nm, ma aumentava a 40 - 50 nm dopo circa 10 ore. Dimensioni così grandi sono inutilizzabili dal punto di vista NMR, perciò abbiamo dapprima ridotto q a 0.5, ottenendo oggetti aventi un raggio di 6 - 10 nm, adatti al legame con una proteina di 100 residui come Syn99. Abbiamo verificato anche quale fosse la stabilità  delle bicelle in presenza di diversi sistemi tampone e diverse forze ioniche con lo stesso tipo di esperimenti, ma la presenza di sali aumentava la viscosità  dei campioni, tanto da renderli difficilmente maneggiabili, perciò abbiamo deciso di lavorare in acqua. Abbiamo testato anche diverse condizioni tramite CD per massimizzare l'interazione Syn99 - bicelle e, anche nel caso delle bicelle, la proteina mostra il classico spettro di un'alfa-elica: è questo il primo dato che vede l'alfa-sinucleina interagire con doppi strati planari. Abbiamo poi visto che tale interazione è favorita da una bassa forza ionica e non è influenzata dalla temperatura e abbiamo determinato, sempre tramite CD, il minimo rapporto fosfolipidi/Syn99 per cui si aveva la massima strutturazione. Nonostante l'ottimizzazione dell'interazione proteina - membrana, non siamo riusciti a raccogliere nessuno spettro NMR significativo, forse a causa dell'elevata dimensione e dell'instabilità  del sistema. Abbiamo, perciò, abbandonato l'idea di studiare il frammento Syn99, e abbiamo proseguito con lo studio dei due frammenti che lo costituiscono (Syn52 e Syn57-102) che insieme formano tutta la porzione N-terminale in grado di interagire con le membrane. Abbiamo preparato bicelle con q = 0.4, che sono molto più piccole e stabili delle precedenti nelle medesime condizioni, secondo i nostri dati DOSY. Abbiamo iniziato studiando Syn52 nelle stesse condizioni di Syn99, che si sono dimostrate le migliori anche per questo frammento. Abbiamo raccolto uno spettro HSQC (il primo su un peptide piùgrande di 30 amminoacidi legato a bicelle) che è stato confrontato con il risultato dello stesso esperimento in presenza di micelle di SDS e si sono notate alcune differenze. Abbiamo anche eseguito e assegnato spettri TOCSY-HSQC e NOESY-HSQC sul campione in SDS e vorremmo ripeterli sul campione in bicelle per esaminare le differenze nei chemical shift e trovare eventuali differenze strutturali, con particolare attenzione per il loop L38 - T44. Abbiamo cercato di ripetere la stessa procedura per Syn57-102, ma non siamo riusciti ad osservare la strutturazione del peptide, anche cambiando pH, temperatura e rapporto DMPG/peptide, in accordo con i dati trovati per il peptide in presenza di SUV grandi. Abbiamo anche cercato di raccogliere uno spettro HSQC senza tuttavia osservare alcun segnale.