Generation of novel zebrafish models of sarcoglycanopathy

Sarcoglycanopathy is the collective name of four rare autosomal recessive diseases belonging to the limb-girdle muscular dystrophies type 2 (LGMD2C-F), due to mutations in SGCG, SGCA, SGCB, SGCD genes coding for γ-, α-, β- and δ- sarcoglycan (SG) respectively. SGs form a tetrameric sub-complex on the sarcolemma, closely linked to the dystrophin associated protein complex (DAPC) and play an essential role in assuring membrane integrity during muscle contraction (Bushby, 2009). Mutations in each SG gene cause the loss/reduction of the mutated protein as well as of the wild type (WT) partners with an alteration of the DAPC structural properties and an increased fragility of the sarcolemma. Most of the known disease-causing mutations are missense mutations that results in a folding defective SG, recognized and prematurely degraded by the endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD) through the proteasome (Gastaldello et al., 2008). The knowledge of the pathological mechanism opens new avenues to two small molecules-based pharmacological interventions. By inhibiting the mutant degradation or assisting its folding the whole SG complex is recovered on the membrane, suggesting that many mutants are still functional although structurally defective (Bianchini et al., 2014; Carotti et al., 2018). Now for the subsequent preclinical test, these in vitro data need to be validated in vivo. To accomplish this task, in the absence of suitable rodent models, zebrafish models carrying missense mutations in SGs are needed to mimic the human condition. Among SGs, β- and δ-SG are the most conserved, therefore they were chosen to mimic sarcoglycanopathy in zebrafish. The nearly identical muscle structure with the human one, the ease to set up functional and drug screening test, make this vertebrate an ideal choice for our task. The proof of concept of the suitability of the model came from the knock-down of δ-SG by using the morpholino technique. Morphants showed altered morphology and compromised swimming ability. On these promising data, we decided to generate novel zebrafish lines in which β- or δ-SG genes are modified by using the CRISPR/Cas9 technique. β- and δ-SG Knock-out (KO) animals have been generated and characterized. The absence of the protein led to the progressive alteration of the muscle structure and impairment of the swimming ability. Presently, KO animals are used as the background for the injection of the WT or mutated sequence of the corresponding SG, of human or zebrafish origin. The injection of the WT sequence should allow the rescue of the phenotype, whereas that of the mutated forms will permit to evaluate the ability of the zebrafish ERAD to recognize and degrade a folding defective SG. This data will be of utmost importance to verify the suitability of zebrafish in mimicking those forms of sarcoglycanopathy due to missense mutations. β-SGT145R/T145R and δ-SGE264K/E264K Knock-in (KI) are presently under production. Since the efficacy of the homologoy direct repair is very low, much effort has been devoted to set up a selective procedure to screen the positive fish. Actually, the screening of the somatic recombinants for the introduction of the T145R mutation in z-sgcb gene was positive. We are presently waiting for the sexual maturation of the F0 population to perform the outcross with WT in order to identify the founder animals, in which the recombination occurred in the germline. If successfully modelling the sarcoglycanopathy conditions, these KI lines will represent a fundamental tool for testing the proposed pharmacological approach and will be a valuable boost for both basic and translational research.

Le sarcoglicanopatie sono quattro rare patologie autosomiche recessive appartenenti alla famiglia delle distrofie muscolari di tipo 2 (LGMD2C-F). Esse sono causate da mutazioni nei geni SGCG, SGCA, SGCB, SGCD codificanti rispettivamente per γ-, α-, β- e δ- sarcoglicano (SG). I SG formano un complesso tetramerico nel sarcolemma, connesso a quello delle glicoproteine associate alla distrofina (DAPC), essenziale per garantire l'integrità della membrana durante la contrazione muscolare (Bushby, 2009). Mutazioni dei SG causano la perdita/riduzione della proteina mutata e dei partner wild type (WT), alterando le proprietà strutturali del DAPC e aumentando la fragilità del sarcolemma. La maggior parte delle mutazioni sono di tipo missenso e, causando un problema nel folding, portano alla prematura degradazione della proteina mutata effettuata dalla via ERAD (degradazione associata al reticolo endoplasmatico) attraverso il proteasoma (Gastaldello et al., 2008; Bartoli et al., 2008). La conoscenza del meccanismo patologico ha aperto nuove strade a due possibili interventi farmacologici: inibendo la degradazione o assistendo il processo di folding dei mutanti, il complesso dei SG è recuperato riducendo così la fragilità della membrana (Bianchini et al., 2014; Carotti et al., 2018). Questi dati prodotti in vitro suggeriscono che molti mutanti sono ancora funzionali, sebbene strutturalmente difettosi. Tuttavia, per la messa a punto di un approccio terapeutico, questi dati necessitano di una validazione in vivo, attraverso modelli animali per mimare la malattia umana e recanti quindi mutazioni missenso nei SG. In assenza di modelli murini, un’alternativa promettente per lo studio di molte malattie, fra cui i disturbi muscolari, è rappresentata dallo zebrafish (D.rerio). Tra gli ortologhi dei SG umani, β- e δ-SG sono i più conservati e quindi sono stati scelti per produrre linee knock-out (KO) e knock-in (KI). La bontà dell’uso di questo vertebrato nel mimare la sarcoglicanopatia nasce da uno studio preliminare di Knock-Down con morfolino contro il δ-SG. I morfanti ottenuti hanno mostrato: alterazioni morfologiche, danni alla struttura muscolare e compromissione delle capacità motorie. Grazie a queste premesse, il sistema CRISPR/Cas9 è stato usato per generare modelli KO di β- e δ-SG. In entrambi i casi, l'assenza della proteina provoca la progressiva alterazione della struttura muscolare e delle capacità motorie. Attualmente stiamo usando i KO come background per l'iniezione della sequenza WT o mutata dei SG, sia di origine umana sia di zebrafish. La prima dovrebbe consentire il recupero del fenotipo, mentre quella delle forme mutate permetterà di valutare la capacità dello zebrafish di riconoscerle e degradarle. Questi esperimenti sono della massima importanza per verificare l'idoneità dello zebrafish nel mimare le forme di sarcoglicanopatia causate da mutazioni missenso. La generazione di due modelli KI in zebrafish, β-SGT145R/T145R e δ-SGE264K/E264K, prevede l’attivazione della via di riparazione HDR (riparazione omologa diretta). Poiché l'efficienza della ricombinazione omologa è molto bassa, è necessario l’uso di un metodo altamente selettivo per identificare i pesci positivi alla voluta mutazione. Lo screening delle mutazioni somatiche per l'introduzione della mutazione T145R nel gene z-sgcb è stato positivo. Attualmente stiamo aspettando la maturazione sessuale della popolazione F0 per identificare quei pesci in cui ricombinazione sia avvenuta nella linea germinale. Se le linee KI, una volta caratterizzate, mimeranno la patologia umana, rappresenteranno uno strumento fondamentale per testare l'approccio farmacologico proposto in vitro, e costituiranno un valido stimolo per la ricerca di base e traslazionale.