Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a lethal childhood muscular disorder characterized clinically by progressive muscle wasting. The onset of the muscular weakness is usually between 3-5 years of age leading to loss ambulation by a mean age of 10.5 years [Allsop & Ziter, 1981] and death is usually due to respiratory or cardiac insufficiency in the early twenties [Dubowitz, 1995]. To date, the only effective pharmacological therapy shown to delay progression of disease is treatment with steroids, that may prolongs ambulation by up to 18 months. Even if the steroids efficacy in DMD is proved, interpatient variability in pharmacological response and a broad variation in the age at which loss of ambulation occurs among steroid-treated DMD patients are also reported. Several analysis of the standard deviation shown that this parameter is often greater than the mean, suggesting a wide distribution of values presumably due to the existence of patients that loss the ambulation either extremely early or late [Silva et al, 1987]. The molecular basis of this phenotypic variability has to be cleared. The long term goal of this work is the dissection of the molecular mechanisms underlying steroid response in DMD patients to identify the predisposing factors to a more favourable disease course. The study relied upon the DMD database maintained by the Neuromuscular Center of the University of Padua and 8 patients with a molecular diagnosis of DMD were selected to enrol in the analysis. All of them have been treated with steroids (deflazacort and prednisolone) until the loss of ambulation. Based upon an arbitrary criteria, these patients were classified as “responder” (R) (n=5) when the loss of ambulation occurs after 13 years of age and as “no-responder” (NR) (n=3) when it occurs before 10 years of age [Bonifati et al, 2000]. To identify the transcripts significantly dysregulated in the two groups of patients, muscle biopsies of the selected patients are used for the expression profiling, performing a microarray analysis using a genome-wide platform (Operon; Huntsville, AL, USA) and a following statistical analysis. After valuation of differentially expressed genes, the study proceeds with the identification of discriminant genes belonging to different groups, responder and no-responder. The analysis led to the identification of 47 deregulated genes in the steroids-responder patients group matched up to no-responder patients group: 10 genes down-regulated, among which several structural genes expressed during development, immune response signals and extracellular matrix genes and 37 genes up-regulated, many of which encoding transcription factors. Subsequently, each of these genes was investigated in order to individuate the molecular pathways involved. Evaluating the interaction networks between the identified genes, two pathways were recognized: the interferon (IFN)-signaling pathway and the NF-kappaB transduction signal cascade. The Nuclear Factor kappa-B (NF-kB) is an ubiquitary transcriptional factor implicated in the regulation of expression of a number of cellular genes involved in immune, inflammatory and anti-apoptotic responses, and found to be increased in mdx (modello murino di DMD) muscle. Several reports suggest that inhibition of NF-kB is a valuable strategy for the treatment of DMD [Acharyya et al, 2007; Mozzetta et al, 2008]. Almost 4 genes among those considerate (IFIT3, IFIT1, STAT1, TFF3) are involved in the NF-kB activation pathway. In order to validate the differential expression of these genes a quantitative real time-PCR test was performed; the analysis has spotlighted expression variability between the patients of the single groups and the existence of an outlier patient. To counter this trouble, a second statistical analysis was carried out comparing each single responder patient with a control patient and the differentially expressed genes were evaluated considering function, physiological expression and gene interaction characteristics. In this list of genes we identified the presence of many members of TNF superfamily (TNF, TNFSF10, LTA, LTB) and a gene coding a putative NF-kB inhibitor, as well as other 5 genes (USMG5, SPP1, S100A9, ICOSLG, LILRA2) selected because of their homogeneous expression profiling. After Real Time-PCR analysis, the gene that survives the test is USMG5 (Up-regulated during Skeletal Muscle Growth 5), subsequently investigated in order to perform a SNP association studies with other two genes chosen through the literature: ACTN3 that encodes the protein ?-actinin 3, a fast-twitch-specific isoform expressed only in type II myofibers, and AKT1 that encodes the serine-threonine protein kinase, involved in the growth factor-I (IGF-1) transduction signal cascade and the NF-kB activation pathway. 110 DMD patients were genotyped for different SNPs, sought out in the existing SNP database, one in each of the candidate gene: R577X in ACTN3, +G205T in AKT1 and S49P in USMG5. The genotype distribution was analysed for the association with the muscle strength using chi squared methods, but statistical significance was not observed. In conclusion, our study has demonstrated the possibility of a priori clustering patients with different clinical progression. The results of this study provides therapeutic alternatives to correct the single gene defect with gene therapy. Further studies are needed to better define the molecular mechanisms underlying the modulation of the phenotype in DMD.

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e’ una malattia neuromuscolare dell’eta’ infantile invariabilmente letale caratterizzata da un deficit di forza progressivo. L’esordio della debolezza muscolare e’ usualmente verso i 3-5 anni e progredisce fino alla perdita della deambulazione in media intorno ai 10 anni e mezzo. L’exitus, nella seconda-terza decade, e’ dovuta alla comparsa di insufficienza respiratoria e/o cardiaca. La sola terapia palliativa efficace nel rallentare la progressione di malattia e’ la terapia steroidea. La somministrazione di steroidi nella DMD risulta nel prolungamento della deambulazione di circa 18 mesi nei pazienti trattati rispetto ai non trattati. Tuttavia l’eta’ alla perdita della deambulazione presenta una ampia deviazione standard dovuta alla presenza sia di pazienti che perdono la deambulazione molto precocemente ed altri molto tardivamente sia nei pazienti trattati che non trattati. Le basi molecolari di questa variabilita’ fenotipica non sono. Nel tentativo di identificare i fattori modulanti favorevolmente il fenotipo clinico, abbiamo studiato 8 pazienti con diagnosi molecolare di DMD. Tutti i pazienti erano stati trattati con steroidi a dosaggio standard fino alla perdita della deambulazione. I pazienti sono stati arbitrariamente classificati come responsivi (R) (n=5) se la perdita della deambulazione e’ avvenuta dopo i 13 anni e non-responsivi (NR) (n=3) se la perdita della deambulazione e’ avvenuta prima dei 10 anni di età. Allo scopo di identificare gruppi di trascritti genici differenzialmente espressi tra i due gruppi di pazienti è stata eseguita un’analisi dei profili d’espressione (Microarray) utilizzando una piattaforma di oligonucleotidi genome-wide (Operon), seguita da un’elaborazione statistica dei dati. Una volta identificati i geni regolati in modo differenziale, lo studio ha mirato all’identificazione di un sottogruppo di geni differenzialmente espressi nei pazienti R e NR. Con tale criterio sono stati individuati nel pool dei pazienti R 47 geni significativamente deregolati rispetto ai pazienti NR: 37 geni sovraespressi, molti dei quali codificanti per fattori di trascrizione, e 10 geni sottoespressi, tra cui geni strutturali normalmente espressi durante lo sviluppo, geni coinvolti nella risposta immunologica e altri che codificano per proteine presenti nella matrice extracellulare. I geni differenzialmente espressi identificati sono stati sottoposti ad analisi funzionale allo scopo di individuare cascate biochimiche in cui essi fossero coinvolti. Valutando l’interazione tra i geni identificati, sono risultati particolarmente significativi la cascata di signaling dell’interferone (IFN) e la cascata di trasduzione del segnale del Fattore Nucleare kappa B (NF-kB), un fattore di trascrizione ubiquitario che regola l’espressione di geni coinvolti nei processi infiammatori e nella risposta acuta allo stress. Dati sperimentali suggeriscono che la regolazione dell’attività di NF-kB possa favorevolmente modulare la progressione della distrofia muscolare nel modello animale di DMD (topo mdx). Almeno 4 tra i geni considerati (IFIT3, IFIT1, STAT1, TFF3) hanno un ruolo nel processo di attivazione di NF-kappaB. Al fine di validare la significativa sovraespressione di questi trascritti nel pool di pazienti “steroido-responsivi” rispetto al pool di pazienti “steroido non-responsivi”, sono stati condotti degli esperimenti di Real Time-PCR. Dall’analisi è emersa una variabilità all’interno dei singoli gruppi. Per ovviare a tale problema, una seconda analisi statistica dei dati è stata eseguita confrontando singolarmente ogni paziente con un controllo scelto in base all’età alla perdita della deambulazione. I geni differenzialmente espressi identificati sono stati valutati in base alle loro caratteristiche di funzione, espressione fisiologica ed interazioni. In questa seconda analisi, si è evidenziato in particolare un coinvolgimento di alcuni membri della superfamiglia del TNF (TNF, TNFS10, LTA, LTB) ed un gene codificante per un putativo inibitore di NF-kappaB (NFKBIL1). Sono stati presi in considerazione anche altri 5 geni (USMG5, SPP1, S100A9, ICOSLG, LILRA2), selezionati perché la loro espressione risultava uniforme all’interno dei due gruppi di pazienti, così da poter eliminare la variabilità intergruppo. Anche in questo caso i dati sono stati necessariamente validati con esperimenti di Real Time-PCR. Il gene che, superato il controllo di validazione, è risultato significativo è USMG5 (Up-regulated during the skeletal muscle growth 5), successivamente studiato allo scopo di identificare polimorfismi di singolo nucleotide (SNP). È stata valutata l’esistenza di SNP noti, consultando il database di SNP, nel gene USMG5 ed in altri 2 geni scelti dalla letteratura: ACTN3 che codifica per la proteina alpha-actinina 3, espressa esclusivamente nel disco Z delle fibre di tipo II del muscolo scheletrico, e AKT1 che codifica per la serina-treonina protein chinase, coinvolta nella trasduzione del segnale dei fattori di crescita come IGF1, oltre ad avere un ruolo nello sviluppo e nella sopravvivenza cellulare e nell’attivare NF-kB. I pazienti sono stati analizzati per il polimorfismo R577X nel gene ACTN3, +G205T nel gene AKT1 e S49P nel gene USMG5. La distribuzione genotipica è stata messa a confronto con la forza muscolare, ma i test non hanno evidenziato differenze statisticamente significative. In conclusione, il nostro studio dei profili di espressione nei pazienti affetti da DMD ha dimostrato la possibilita’ di clusterizzare a priori pazienti con progressione clinica diversa. Questo risultato e’ rilevante considerando che implica la possibilita’ che alla base della progressione di malattia nella DMD vi sia una regolazione genica differenziale. Questo dato offre strategie terapeutiche alternative alla sola correzione del difetto genico con terapia genica o cellulare. Ulteriori studi sono necessari per definire meglio i meccanismi molecolari alla base della modulazione del fenotipo nella DMD.

Identificazione di geni differenzialmente espressi nella distrofia muscolare di Duchenne e loro ruolo nella progressione di malattia / Gavassini, Bruno Francesco. - (2009 Jan 31).

Identificazione di geni differenzialmente espressi nella distrofia muscolare di Duchenne e loro ruolo nella progressione di malattia

Gavassini, Bruno Francesco
2009

Abstract

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a lethal childhood muscular disorder characterized clinically by progressive muscle wasting. The onset of the muscular weakness is usually between 3-5 years of age leading to loss ambulation by a mean age of 10.5 years [Allsop & Ziter, 1981] and death is usually due to respiratory or cardiac insufficiency in the early twenties [Dubowitz, 1995]. To date, the only effective pharmacological therapy shown to delay progression of disease is treatment with steroids, that may prolongs ambulation by up to 18 months. Even if the steroids efficacy in DMD is proved, interpatient variability in pharmacological response and a broad variation in the age at which loss of ambulation occurs among steroid-treated DMD patients are also reported. Several analysis of the standard deviation shown that this parameter is often greater than the mean, suggesting a wide distribution of values presumably due to the existence of patients that loss the ambulation either extremely early or late [Silva et al, 1987]. The molecular basis of this phenotypic variability has to be cleared. The long term goal of this work is the dissection of the molecular mechanisms underlying steroid response in DMD patients to identify the predisposing factors to a more favourable disease course. The study relied upon the DMD database maintained by the Neuromuscular Center of the University of Padua and 8 patients with a molecular diagnosis of DMD were selected to enrol in the analysis. All of them have been treated with steroids (deflazacort and prednisolone) until the loss of ambulation. Based upon an arbitrary criteria, these patients were classified as “responder” (R) (n=5) when the loss of ambulation occurs after 13 years of age and as “no-responder” (NR) (n=3) when it occurs before 10 years of age [Bonifati et al, 2000]. To identify the transcripts significantly dysregulated in the two groups of patients, muscle biopsies of the selected patients are used for the expression profiling, performing a microarray analysis using a genome-wide platform (Operon; Huntsville, AL, USA) and a following statistical analysis. After valuation of differentially expressed genes, the study proceeds with the identification of discriminant genes belonging to different groups, responder and no-responder. The analysis led to the identification of 47 deregulated genes in the steroids-responder patients group matched up to no-responder patients group: 10 genes down-regulated, among which several structural genes expressed during development, immune response signals and extracellular matrix genes and 37 genes up-regulated, many of which encoding transcription factors. Subsequently, each of these genes was investigated in order to individuate the molecular pathways involved. Evaluating the interaction networks between the identified genes, two pathways were recognized: the interferon (IFN)-signaling pathway and the NF-kappaB transduction signal cascade. The Nuclear Factor kappa-B (NF-kB) is an ubiquitary transcriptional factor implicated in the regulation of expression of a number of cellular genes involved in immune, inflammatory and anti-apoptotic responses, and found to be increased in mdx (modello murino di DMD) muscle. Several reports suggest that inhibition of NF-kB is a valuable strategy for the treatment of DMD [Acharyya et al, 2007; Mozzetta et al, 2008]. Almost 4 genes among those considerate (IFIT3, IFIT1, STAT1, TFF3) are involved in the NF-kB activation pathway. In order to validate the differential expression of these genes a quantitative real time-PCR test was performed; the analysis has spotlighted expression variability between the patients of the single groups and the existence of an outlier patient. To counter this trouble, a second statistical analysis was carried out comparing each single responder patient with a control patient and the differentially expressed genes were evaluated considering function, physiological expression and gene interaction characteristics. In this list of genes we identified the presence of many members of TNF superfamily (TNF, TNFSF10, LTA, LTB) and a gene coding a putative NF-kB inhibitor, as well as other 5 genes (USMG5, SPP1, S100A9, ICOSLG, LILRA2) selected because of their homogeneous expression profiling. After Real Time-PCR analysis, the gene that survives the test is USMG5 (Up-regulated during Skeletal Muscle Growth 5), subsequently investigated in order to perform a SNP association studies with other two genes chosen through the literature: ACTN3 that encodes the protein ?-actinin 3, a fast-twitch-specific isoform expressed only in type II myofibers, and AKT1 that encodes the serine-threonine protein kinase, involved in the growth factor-I (IGF-1) transduction signal cascade and the NF-kB activation pathway. 110 DMD patients were genotyped for different SNPs, sought out in the existing SNP database, one in each of the candidate gene: R577X in ACTN3, +G205T in AKT1 and S49P in USMG5. The genotype distribution was analysed for the association with the muscle strength using chi squared methods, but statistical significance was not observed. In conclusion, our study has demonstrated the possibility of a priori clustering patients with different clinical progression. The results of this study provides therapeutic alternatives to correct the single gene defect with gene therapy. Further studies are needed to better define the molecular mechanisms underlying the modulation of the phenotype in DMD.
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) e’ una malattia neuromuscolare dell’eta’ infantile invariabilmente letale caratterizzata da un deficit di forza progressivo. L’esordio della debolezza muscolare e’ usualmente verso i 3-5 anni e progredisce fino alla perdita della deambulazione in media intorno ai 10 anni e mezzo. L’exitus, nella seconda-terza decade, e’ dovuta alla comparsa di insufficienza respiratoria e/o cardiaca. La sola terapia palliativa efficace nel rallentare la progressione di malattia e’ la terapia steroidea. La somministrazione di steroidi nella DMD risulta nel prolungamento della deambulazione di circa 18 mesi nei pazienti trattati rispetto ai non trattati. Tuttavia l’eta’ alla perdita della deambulazione presenta una ampia deviazione standard dovuta alla presenza sia di pazienti che perdono la deambulazione molto precocemente ed altri molto tardivamente sia nei pazienti trattati che non trattati. Le basi molecolari di questa variabilita’ fenotipica non sono. Nel tentativo di identificare i fattori modulanti favorevolmente il fenotipo clinico, abbiamo studiato 8 pazienti con diagnosi molecolare di DMD. Tutti i pazienti erano stati trattati con steroidi a dosaggio standard fino alla perdita della deambulazione. I pazienti sono stati arbitrariamente classificati come responsivi (R) (n=5) se la perdita della deambulazione e’ avvenuta dopo i 13 anni e non-responsivi (NR) (n=3) se la perdita della deambulazione e’ avvenuta prima dei 10 anni di età. Allo scopo di identificare gruppi di trascritti genici differenzialmente espressi tra i due gruppi di pazienti è stata eseguita un’analisi dei profili d’espressione (Microarray) utilizzando una piattaforma di oligonucleotidi genome-wide (Operon), seguita da un’elaborazione statistica dei dati. Una volta identificati i geni regolati in modo differenziale, lo studio ha mirato all’identificazione di un sottogruppo di geni differenzialmente espressi nei pazienti R e NR. Con tale criterio sono stati individuati nel pool dei pazienti R 47 geni significativamente deregolati rispetto ai pazienti NR: 37 geni sovraespressi, molti dei quali codificanti per fattori di trascrizione, e 10 geni sottoespressi, tra cui geni strutturali normalmente espressi durante lo sviluppo, geni coinvolti nella risposta immunologica e altri che codificano per proteine presenti nella matrice extracellulare. I geni differenzialmente espressi identificati sono stati sottoposti ad analisi funzionale allo scopo di individuare cascate biochimiche in cui essi fossero coinvolti. Valutando l’interazione tra i geni identificati, sono risultati particolarmente significativi la cascata di signaling dell’interferone (IFN) e la cascata di trasduzione del segnale del Fattore Nucleare kappa B (NF-kB), un fattore di trascrizione ubiquitario che regola l’espressione di geni coinvolti nei processi infiammatori e nella risposta acuta allo stress. Dati sperimentali suggeriscono che la regolazione dell’attività di NF-kB possa favorevolmente modulare la progressione della distrofia muscolare nel modello animale di DMD (topo mdx). Almeno 4 tra i geni considerati (IFIT3, IFIT1, STAT1, TFF3) hanno un ruolo nel processo di attivazione di NF-kappaB. Al fine di validare la significativa sovraespressione di questi trascritti nel pool di pazienti “steroido-responsivi” rispetto al pool di pazienti “steroido non-responsivi”, sono stati condotti degli esperimenti di Real Time-PCR. Dall’analisi è emersa una variabilità all’interno dei singoli gruppi. Per ovviare a tale problema, una seconda analisi statistica dei dati è stata eseguita confrontando singolarmente ogni paziente con un controllo scelto in base all’età alla perdita della deambulazione. I geni differenzialmente espressi identificati sono stati valutati in base alle loro caratteristiche di funzione, espressione fisiologica ed interazioni. In questa seconda analisi, si è evidenziato in particolare un coinvolgimento di alcuni membri della superfamiglia del TNF (TNF, TNFS10, LTA, LTB) ed un gene codificante per un putativo inibitore di NF-kappaB (NFKBIL1). Sono stati presi in considerazione anche altri 5 geni (USMG5, SPP1, S100A9, ICOSLG, LILRA2), selezionati perché la loro espressione risultava uniforme all’interno dei due gruppi di pazienti, così da poter eliminare la variabilità intergruppo. Anche in questo caso i dati sono stati necessariamente validati con esperimenti di Real Time-PCR. Il gene che, superato il controllo di validazione, è risultato significativo è USMG5 (Up-regulated during the skeletal muscle growth 5), successivamente studiato allo scopo di identificare polimorfismi di singolo nucleotide (SNP). È stata valutata l’esistenza di SNP noti, consultando il database di SNP, nel gene USMG5 ed in altri 2 geni scelti dalla letteratura: ACTN3 che codifica per la proteina alpha-actinina 3, espressa esclusivamente nel disco Z delle fibre di tipo II del muscolo scheletrico, e AKT1 che codifica per la serina-treonina protein chinase, coinvolta nella trasduzione del segnale dei fattori di crescita come IGF1, oltre ad avere un ruolo nello sviluppo e nella sopravvivenza cellulare e nell’attivare NF-kB. I pazienti sono stati analizzati per il polimorfismo R577X nel gene ACTN3, +G205T nel gene AKT1 e S49P nel gene USMG5. La distribuzione genotipica è stata messa a confronto con la forza muscolare, ma i test non hanno evidenziato differenze statisticamente significative. In conclusione, il nostro studio dei profili di espressione nei pazienti affetti da DMD ha dimostrato la possibilita’ di clusterizzare a priori pazienti con progressione clinica diversa. Questo risultato e’ rilevante considerando che implica la possibilita’ che alla base della progressione di malattia nella DMD vi sia una regolazione genica differenziale. Questo dato offre strategie terapeutiche alternative alla sola correzione del difetto genico con terapia genica o cellulare. Ulteriori studi sono necessari per definire meglio i meccanismi molecolari alla base della modulazione del fenotipo nella DMD.
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Identificazione di geni differenzialmente espressi nella distrofia muscolare di Duchenne e loro ruolo nella progressione di malattia / Gavassini, Bruno Francesco. - (2009 Jan 31).
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