Development of bioinformatics tools to predict disease predisposition from Next Generation Sequencing (NGS) data.

The sequencing of the human genome has opened up completely new avenues in research and the notion of personalized medicine has become common. DNA Sequencing technology has evolved by several orders of magnitude, coming into the range of $1,000 for a complete human genome. The promise of identifying genetic variants that influence our lifestyles and make us susceptible to diseases is now becoming reality. However, genome interpretation remains one the most challenging problems of modern biology. The focus of my PhD project is the development of bioinformatics tools to predict diseases predisposition from sequencing data. Several of these methods have been tested in the context of the Critical Assessment of Genome Interpretation (CAGI), always achieving good prediction performances. During my PhD project I faced the complete spectrum of challenges to be address in order to translate the sequencing revolution into clinical practice. One of the biggest problem when dealing with sequencing data is the interpretation of variants pathogenic effect. Dozens of bioinformatics tools have been created to separate mutations that could be involved in a pathogenic phenotype from neutral variants. In this context the problem of benchmarking is critical, as prediction performance are usually tested on different sets of variants, making the comparison among these tools impossible. To address this problem I performed a blinded comparison of pathogenicity predictors in the context of CAGI, realizing the most complete performance assessment among all the iterations of this collaborative experiment. Another challenge that needs to be address to realize the personalized medicine revolution is the phenotype prediction. During my PhD I had the opportunity to develop several methods for the complex phenotype prediction from targeted enrichment and exome sequencing data. In this context challenges like misinterpretation or overinterpretation of variants pathogenicity have emerged, like in the case of phenotype prediction from the Hopkins Clinical Panel. In addition, other complementary issues of phenotype predictions, like the possible presence of incidental findings have to be considered. Ad hoc prediction strategies have been defined while facing with different kinds of sequencing data. A clear example is the case of Crohn’s disease risk prediction. Always in the context of the CAGI experiment, three iterations of this prediction challenge have been run so far. Analysis of datasets revealed how population structure and bias in data preparation and sequencing could affect prediction performance, leading to inflated results. For this reason a completely new prediction strategy has been defined for the last edition of the Crohn’s disease challenge, exploiting data from Genome Wide Association Studies and Protein Protein Interaction network, to address the problem of missing heritability. Good prediction performance have been achieved, especially for individuals with an extreme predicted risk score. Last, my work has been focused on the prediction of a health related trait: the blood group phenotype. The accuracy of serological tests is very poor for minor blood groups or weak phenotypes. Blood groups incompatibilities can be harmful for critical individuals like oncohematological patients. BOOGIE exploits haplotype tables, and the nearest neighbor algorithm to identify the correct phenotype of a patient. The accuracy of our method has been tested in ABO and RhD systems achieving good results. In addition, our analyses paved the way for a further increase in performance, moving towards a prediction system that in the future could become a real alternative to wet lab experiments.

Il completamento del progetto genoma umano ha aperto numerosi nuovi orizzonti di ricerca. Tra questi, la possibilità di conoscere le basi genetiche che rendono ogni individuo suscettibile alle diverse malattie ha aperto la strada ad una nuova rivoluzione: l’avvento della medicina personalizzata. Le tecnologie di sequenziamento del DNA hanno subito una notevole evoluzione, ed oggi il prezzo per sequenziare un genoma è ormai prossimo alla soglia psicologica dei $ 1 000. La promessa di identificare varianti genetiche che influenzano il nostro stile di vita e che ci rendono suscettibili alle malattie sta quindi diventando realtà. Tuttavia, molto lavoro è ancora necessario perché questo nuovo tipo di medicina possa trasformarsi in realtà. In particolare la sfida oggi non è più data dalla generazione dei dati di sequenziamento, ma è rappresentata invece dalla loro interpretazione. L'obiettivo del mio progetto di dottorato è lo sviluppo di metodi bioinformatici per predire la predisposizione a patologie, a partire da dati di sequenziamento. Molti di questi metodi sono stati testati nel contesto del Critical Assessment of Genome Interpretation (CAGI), una competizione internazionale focalizzata nel definire lo stato dell’arte per l’interpretazione del genoma, ottenendo sempre buoni risultati. Durante il mio progetto di dottorato ho avuto l'opportunità di affrontare l’intero spettro delle sfide che devono essere gestite per tradurre le nuove capacità di sequenziamento del genoma in pratica clinica. Uno dei problemi principali che si devono gestire quando si ha a che fare con dati di sequenziamento è l'interpretazione della patogenicità delle mutazioni. Decine di predittori sono stati creati per separare varianti neutrali dalle mutazioni che possono essere causa di un fenotipo patologico. In questo contesto il problema del benchmarking è fondamentale, in quanto le prestazioni di questi tool sono di solito testate su diversi dataset di varianti, rendendo impossibile un confronto di performance. Per affrontare questo problema, una comparazione dell’accuratezza di questi predittori è stata effettuata su un set di mutazioni con fenotipo ignoto nel contesto del CAGI, realizzando la valutazione per predittori di patogenicità più completa tra tutte le edizioni di questo esperimento collaborativo. La previsione di fenotipi a partire da dati di sequenziamento è un'altra sfida che deve essere affrontata per realizzare le promesse della medicina personalizzata. Durante il mio dottorato ho avuto l'opportunità di sviluppare diversi predittori per fenotipi complessi utilizzando dati provenienti da pannelli genici ed esomi. In questo contesto sono stati affrontati problemi come errori di interpretazione o la sovra interpretazione della patogenicità della varianti, come nel caso della sfida focalizzata sulla predizione di fenotipi a partire dall’Hopkins Clinical Panel. Sono inoltre emersi altri problemi complementari alla previsione di fenotipo, come per esempio la possibile presenza di risultati accidentali. Specifiche strategie di predizione sono state definite lavorando con diversi tipi di dati di sequenziamento. Un esempio è dato dal morbo di Crohn. Tre edizioni del CAGI hanno proposto la sfida di identificare individui sani o affetti da questa patologia infiammatoria utilizzando unicamente dati di sequenziamento dell’esoma. L'analisi dei dataset ha rivelato come la presenza di struttura di popolazione e problemi nella preparazione e sequenziamento degli esomi abbiano compromesso le predizioni per questo fenotipo, generando una sovrastima delle performance di predizione. Tenendo in considerazione questo dato è stata definita una strategia di predizione completamente nuova per questo fenotipo, testata in occasione dell'ultima edizione del CAGI. Dati provenienti da studi di associazione GWAS e l’analisi delle reti di interazione proteica sono stati utilizzati per definire liste di geni coinvolti nell’insorgenza della malattia. Buone performance di predizione sono state ottenute in particolare per gli individui a cui era stata assegnata una elevata probabilità di essere affetti. In ultima istanza, il mio lavoro è stato focalizzato sulla predizione di gruppi sanguigni, sempre a partire da dati di sequenziamento. L'accuratezza dei test sierologici, infatti, è ridotta in caso di gruppi di sangue minori o fenotipi deboli. Incompatibilità per tali gruppi sanguigni possono essere critiche per alcune classi di individui, come nel caso dei pazienti oncoematologici. La nostra strategia di predizione ha sfruttato i dati genotipici per geni che codificano per gruppi sanguigni, presenti in database dedicati, e il principio di nearest neighbour per effettuare le predizioni. L’accuratezza del nostro metodo è stata testata sui sistemi ABO e RhD ottenendo buone performance di predizione. Inoltre le nostre analisi hanno aperto la strada ad un ulteriore aumento delle prestazioni per questo tool.