An apparently useless conserved gene in Rhizobium sullae

Rhizobium sullae, a nitrogen fixing symbiotic bacterium, induces nodules formation on Hedysarum coronarium L. Although the ability to denitrify may enhance bacterial survival and growth capability in anaerobic soils, denitrification among rhizobia is rare, and only B. japonicum and A. caulinodans have been shown to be true denitrifiers, reducing nitrate (NO3-) simultaneously to both NH4+(assimilation) and N2 (denitrification), when cultured microaerobically with nitrate as the only nitrogen source. R sullae strain HCNT1 has been shown to have a copper-containing nitrite reductase (Nir), producing nitric oxide (NO), encoded by a nirK gene, but not a complementary nitric oxide reductase and the other enzymes required for a complete denitrification pathway. Expression of nirK is atypical in that it does not require the presence of a nitrogen oxide, but only a decrease in oxygen concentration. Reduction of nitrite (NO2-) by strain HCNT1 results in the inhibition of growth due to the accumulation of NO to toxic levels, suggesting that R. sullae does not contain any Nor (nitric-oxide reductase). Nodulation, plant growth and rates of N2 fixation are similar between wild-type and nirK-deficient strains. The physiological role of the truncated denitrification chain found in R. sullae is not obvious. It is possible that Nir activity allows the bacteria to convert into a VBNC form, which would survive for long periods under stress conditions without loss of the ability to recover the vegetative state. Recently strain HCNT1 was found to be able to grow in the presence of high concentration of selenite (50 mM); moreover, during the growth, selenite was reduced to less toxic elemental red selenium, as indicated by the appearance of red colour in the culture. A mutant strain of HCNT1, HCAT2, lacking nitrite reductase, showed no evidence of selenite reduction, grew poorly in the presence of 5 mM of selenite and was unable to grow in the presence of higher concentrations (25 or 50 mM). Other strains, like A4, isolated from the same site where HCNT1 was originally collected, showed a similar behaviour of HCNT1, while its nirK- mutant, a became similar to HCAT2. Once again, the loss of nirK gene seemed to make strains much more sensitive to selenite. Furthermore, a naturally occurring nitrite reductase deficient R. sullae, strain CC1335, isolated from a quite different site, was found unable to grow in the presence of selenite. Mobilization of nirK gene of HCNT1 into CC1335 increased its resistance to this oxyanions. These data have suggested that nitrite reductase of R. sullae could provide resistance to selenite indicating a possible explanation for the radically truncated denitrification chain, found uniquely in this bacterium. On the basis that Nir was able to reduce different oxyanions in addition to nitrite, such as selenite, it has been proposed a multifunction mechanism for nitrite reductase. In order to support this hypothesis, any possible correlation between nitrite and selenite reduction was evaluated. It was demonstrated that selenite reduction occurs either in aerobic or in anaerobic condition and that it is a constitutive enzymatic activity, unlike nitrite reduction activity that requires the induction after a period of incubation under limiting oxygen conditions. Moreover, the addition of nitrite in the culture containing selenite did not prevent the reduction of this oxyanion to elemental selenium form. On the other hand, the presence of selenite in cultures containing nitrite prevented the production of nitric oxide, either if it was added before or at the end of the induction phase. The enzyme responsible of selenite reduction has shown to contain copper, since it responds exactly like the known Cu-nitrite reductase to the addition of a specific chelator (DDC) , that completely inhibited selenite reduction and the consequent appearance of the red colour. Therefore, protein purification became critical in order to better understand its properties. This activity requires a suitable strategy and an appropriate biological system. E. coli, generally used for this purposes, showed to possess different metabolic pathways leading to reduce selenite to elemental selenium. In order to unambiguously proceed to the production and purification of Nir, the construction of a recombinant protein polyhistidine-tagged (6xHis) for the expression in E. coli and the subsequent affinity purification, was carried out. This produced a unexpected delay for the last experiments. However, Nir protein has been purified and some tests for nitrite and selenite reduction activities were performed with the aim to clarify if the two enzymes are the same protein working in a different way, depending upon the substrate and the general conditions adopted. The preliminary approach on a first fraction of the purified protein indicated that the conditions required for its expression and possibly the purification method adopted, can consistently affect the expression of the protein as nitrite or selenite reductase. While the reduction of nitrite has been successfully verified, medium-long periods of time are required to obtain the right amount of the purified enzyme to be used in all the possible expression conditions.

Rhizobium sullae, un batterio azotofissatore, induce la formazione di noduli radicali in Hedysarum coronarium L., una leguminosa foraggiera conosciuta in Italia con il nome di sulla e spontanea in quasi tutto il bacino del Mediterraneo, considerato il suo areale d’origine. Sebbene la capacità di denitrificare possa essere utile alla sopravvivenza e alla crescita delle cellule batteriche in ambienti anossici, il processo di denitrificazione tra i rizobi è piuttosto raro. Soltanto B. japonicum e A. caulinodans si comportano come i veri denitrificanti, riducendo il nitrato (NO3-) simultaneamente a NH4+(assimilazione) e N2 (denitrificazione), quando fatti crescere, in condizioni di microaerofilia, in colture contenenti nitrato come sola fonte di azoto. R sullae strain HCNT1 ha dimostrato di possedere una nitrito riduttasi contenente rame (Cu-Nir), in grado di produrre ossido nitrico (NO) e codificata dal gene nirK, mentre non possiede invece l’ossido nitrico riduttasi e gli altri enzimi richiesti per il processo completo di denitrificazione. L’espressione del gene nirK è atipica e unica nel suo genere, poiché non richiede la presenza del suo substrato, il nitrito (NO2-), ma soltanto di una diminuzione della concentrazione di ossigeno in una fase di induzione. La riduzione del nitrito da parte del ceppo HCNT1 provoca l’inibizione della crescita cellulare, a causa dell’accumulo di NO a livelli tossici per la cellula microbica, a conferma che R. sullae non contiene l’enzima Nor (ossido nitrico reduttasi). Il processo di nodulazione, la crescita della pianta ospite e la capacità azoto-fissatrice del ceppo wild-type sono del tutto simili a quelle riscontrate nei ceppi mutanti nirK-. L’esistenza di un ruolo fisiologico per la catena di denitrificazione interrotta riscontrata in R. sullae non ha in realtà una spiegazione ovvia. È possibile che l’attività dell’enzima Nir permetta alle cellule batteriche di convertirsi nella forma VBNC (viable-but-not-culturable), in modo tale che possano sopravvivere in condizioni di stress anche per lunghi periodi, senza perdere tuttavia la capacità di riprendere lo stato vegetativo. Recentemente il ceppo HCNT1 ha dimostrato di possedere la capacità di crescere in presenza di alte concentrazioni di selenito (50 mM); inoltre, durante la crescita, il selenito è stato ridotto a selenio elementare non tossico e di colore rosso. Un ceppo mutante di HCNT1, HCAT2, privo del gene per la nitrito riduttasi, non ha mostrato tuttavia la stessa capacità del wild-type di ridurre il selenito, non essendo in grado di crescere in mezzi colturali contenenti selenito 25 o 50 mM, o avendo scarsa capacità di crescere anche in presenza di basse concentrazioni di selenito (5 mM). Un altro ceppo di R. sullae, denominato A4, è stato isolato dallo stesso suolo dove in precedenza era stato isolato il ceppo HCNT1. Il ceppo A4 ha mostrato un comportamento molto simile a HCNT1 per quanto riguarda la risposta alla presenza del selenito nel mezzo di coltura, mentre il mutante A4 nirK- un comportamento più simile a quello del ceppo HCAT2. La mancanza del gene nirK sembra quindi rendere i ceppi molto più sensibili alla presenza dell’ossianione del selenio. A confermare questa evidenza, un ceppo wild-type privo del gene nirK, R. sullae CC1335, isolato in un ambiente diverso da quello di HCNT1 e A4, ha mostrato la sua incapacità di crescere in presenza di selenito. D’altra parte, il trasferimento del gene nirK di HCNT1 nel ceppo CC1335 ha contribuito ad incrementare la sua resistenza a questo ossianione. I dati raccolti in questi esperimenti hanno suggerito, quindi, la possibilità che la nitrito riduttasi di R. sullae possa far parte di un meccanismo responsabile della resistenza al selenito, indicando una spiegazione plausibile per l’esistenza della catena di denitrificazione radicalmente troncata e riscontrata unicamente in questo batterio. Tenendo presente la capacità di Nir di ridurre differenti ossianioni oltre al nitrito, come ad esempio il selenito, è stato proposto per questo enzima un meccanismo di multifunzionamento, ovvero la proteina Nir potrebbe agire da nitrito o da selenito riduttasi in base al substrato e alle condizioni aerobiche o anaerobiche in cui si trova il microrganismo. Al fine di supportare quest’ultima ipotesi, sono state valutate le possibili correlazioni esistenti tra i sistemi di riduzione dei due ossianioni. In particolare è stato dimostrato che la riduzione del selenito avviene sia in condizioni aerobiche che anaerobiche, e che si tratta di una attività enzimatica costitutiva, a differenza dell’attività nitrito riduttasica, la quale richiede un periodo di induzione in condizioni limitanti di ossigeno. È stato riscontrato, inoltre, che l’aggiunta di nitrito in una coltura già contenente selenito non interferisce con la riduzione di quest’ultimo ossianione alla forma elementare del selenio. Al contrario, l’aggiunta di selenito a colture già contenenti nitrito ha mostrato di inibire la produzione degli ossidi di azoto, nei casi in cui venga aggiunto prima, durante o dopo la fase di incubazione in microaerofilia. L’utilizzo di uno specifico chelante delle nitrito reduttasi contenenti rame (Cu-Nir) insieme al selenito contenuto nel un mezzo colturale, ha rivelato che l’enzima responsabile della riduzione del selenito in R. sullae contiene rame, poiché l’attività selenito reduttasica viene inibita e non vi è formazione del colore rosso. Si è dunque reso necessario procedere alla purificazione della proteina al fine di studiarne più in dettaglio le proprietà. Ciò ha comportato la ricerca di una strategia adeguata che facesse uso di un sistema biologico appropriato. E. coli, generalmente utilizzato a questo scopo, ha mostrato di possedere vie metaboliche che portano alla riduzione del selenito a selenio elementare. Al fine di procedere in maniera inequivocabile alla produzione e purificazione della proteina è stato quindi necessario ricorrere alla costruzione di una proteina ricombinante marcata con istidina (6xHis) per l’espressione in E. coli, per poter poi procedere alla purificazione per affinità. Ciò ha comportato un ritardo imprevisto sulla tabella di marcia delle attività di dottorato. Tuttavia la proteina Nir è stata infine purificata e sono stati condotti saggi in vitro per testarne l’effettiva capacità di ridurre il nitrito e il selenito separatamente. In tal modo è possibile chiarire se la nitrito e la selenito riduttasi sono la stessa proteina che lavora in modo diverso a seconda del substrato e delle condizioni in cui si trovano le cellule batteriche, o se si tratta di due proteine distinte che lavorano indipendentemente. L’approccio preliminare che è stato possibile attuare su una prima frazione di proteina purificata ha indicato che le condizioni di espressione e il metodo di purificazione possono avere una grande influenza sull’espressione stessa. Mentr la riduzione del nitrito è stato già verificata con successo, occorreranno tempi un po’ più lunghi per ottenere discrete quantità dell’enzima da utilizzare in tutte le potenziali condizioni di espressione.