Aims Adult COVID-19 is mainly respiratory illness, but in children GI symptoms are more frequent. Furthermore, fetuses are rarely affected by COVID-19. Organoids are a relatively new tool to in vitro establish long-living culture that three-dimensionally resemble the tissue of origin and may both maintain the stemness and fully differentiate in all cell types. As a proof of concept, we aimed to develop a culture system for gastrointestinal organoids (GIOs) to investigate SARS-CoV-2 infection in gastric epithelium across the lifespan. Methods GIO were derived from 8-21 week fetuses and from pediatric and adult tissues. They were cultured using chemically-defined medium, to test their ability to maintain stemness and to fully differentiate. GIO were analyzed in correlation to the surrounding ECM. Reverse cellular polarity Organoids (RP-GOs) were induced and incubated with SARS-CoV-2. All experiments were analyzed by qPCR, immunofluorescence and qualitative analysis as appropriate. Results Gastrointestinal organoids can be isolated from all gestational ages, demonstrating normal gastric epithelial morphology and expressing mature gastric cell types including, the niche, secretive, and enteroendocrine cells. These cultures may be maintained indefinitely in vitro and cultured in GMP-compliant conditions. RP-GOs exhibit apical-out polarity, exposing ACE2 on the external surface, optimizing conditions for viral infection. Viral nucleoprotein was demonstrated in cells undergoing apoptosis, with pediatric RP-GOs most susceptible and efficiently infected compared to fetal and adult organoids. Conclusions We have successfully established an efficient gastrointestinal organoid culture systems for all ages, from fetal life to adulthood. Organoid-based technology can be used for in vitro disease modelling, drug testing or cell therapy. The application of GMP compliant rules makes the clinical translation closer.

Obiettivi Il COVID-19 è una malattia principalmente respiratoria nell’età adulta; nei bambini, al contrario, i sintomi gastrointestinali sono più frequenti. Inoltre, non si conoscono i meccanismi di infezione in epoca fetale, epoca in cui i pazienti sono raramente colpiti da COVID-19. Gli organoidi sono uno strumento relativamente nuovo per stabilire in vitro colture di lunga durata che assomigliano tridimensionalmente al tessuto di origine e possono sia mantenere la staminalità che differenziarsi completamente in tutti i tipi di cellule. Abbiamo quindi mirato a sviluppare un sistema di coltura per organoidi gastrointestinali (GIO) per studiare l'infezione da SARS-CoV-2 nell'epitelio gastrico lungo tutta la durata della vita. Metodi I GIO sono stati derivati da feti di 8-21 settimane e da tessuti pediatrici e adulti. Sono stati coltivati utilizzando un terreno chimicamente definito, per testare la loro capacità di mantenere la forma e di differenziarsi completamente. GIO sono stati analizzati in correlazione all'ECM circostante. Gli organoidi sono stati quindi indotti a differenziarsi nella forma a polarità cellulare inversa (RP-GO) e quindi incubati con SARS-CoV-2. Tutti gli esperimenti sono stati analizzati mediante qPCR, immunofluorescenza e analisi qualitativa a seconda dei casi. Risultati Gli organoidi gastrointestinali possono essere isolati da tutte le età gestazionali, dimostrando la normale morfologia dell'epitelio gastrico ed esprimendo tipi di cellule mature, comprese le cellule della nicchia, del villo/ghiandola e di tipo enteroendocrino. Queste colture possono essere mantenute indefinitamente in vitro e coltivate in condizioni conformi alle indicazioni GMP. Gli RP-GO mostrano polarità apicale, esponendo ACE2 sulla superficie esterna, ottimizzando le condizioni per l'infezione virale. La nucleoproteina virale è stata dimostrata nelle cellule in fase di apoptosi, con gli RP-GO pediatrici più suscettibili ed infettati in modo efficiente rispetto agli organoidi fetali e adulti. Conclusioni Abbiamo stabilito con successo un efficiente sistema di coltura di organoidi gastrointestinali per tutte le età, dalla vita fetale all'età adulta. La tecnologia basata sugli organoidi può essere utilizzata per modelli di malattie in vitro, test sui farmaci o terapia cellulare. L'applicazione di regole conformi alle GMP rende la traduzione clinica più vicina.

Organoidi gastrointestinali pediatrici e fetali: modello di cultura tridimensionale in vitro / Zambaiti, Elisa. - (2022 Mar 09).

Organoidi gastrointestinali pediatrici e fetali: modello di cultura tridimensionale in vitro

ZAMBAITI, ELISA
2022-03-09T00:00:00+01:00

Abstract

Obiettivi Il COVID-19 è una malattia principalmente respiratoria nell’età adulta; nei bambini, al contrario, i sintomi gastrointestinali sono più frequenti. Inoltre, non si conoscono i meccanismi di infezione in epoca fetale, epoca in cui i pazienti sono raramente colpiti da COVID-19. Gli organoidi sono uno strumento relativamente nuovo per stabilire in vitro colture di lunga durata che assomigliano tridimensionalmente al tessuto di origine e possono sia mantenere la staminalità che differenziarsi completamente in tutti i tipi di cellule. Abbiamo quindi mirato a sviluppare un sistema di coltura per organoidi gastrointestinali (GIO) per studiare l'infezione da SARS-CoV-2 nell'epitelio gastrico lungo tutta la durata della vita. Metodi I GIO sono stati derivati da feti di 8-21 settimane e da tessuti pediatrici e adulti. Sono stati coltivati utilizzando un terreno chimicamente definito, per testare la loro capacità di mantenere la forma e di differenziarsi completamente. GIO sono stati analizzati in correlazione all'ECM circostante. Gli organoidi sono stati quindi indotti a differenziarsi nella forma a polarità cellulare inversa (RP-GO) e quindi incubati con SARS-CoV-2. Tutti gli esperimenti sono stati analizzati mediante qPCR, immunofluorescenza e analisi qualitativa a seconda dei casi. Risultati Gli organoidi gastrointestinali possono essere isolati da tutte le età gestazionali, dimostrando la normale morfologia dell'epitelio gastrico ed esprimendo tipi di cellule mature, comprese le cellule della nicchia, del villo/ghiandola e di tipo enteroendocrino. Queste colture possono essere mantenute indefinitamente in vitro e coltivate in condizioni conformi alle indicazioni GMP. Gli RP-GO mostrano polarità apicale, esponendo ACE2 sulla superficie esterna, ottimizzando le condizioni per l'infezione virale. La nucleoproteina virale è stata dimostrata nelle cellule in fase di apoptosi, con gli RP-GO pediatrici più suscettibili ed infettati in modo efficiente rispetto agli organoidi fetali e adulti. Conclusioni Abbiamo stabilito con successo un efficiente sistema di coltura di organoidi gastrointestinali per tutte le età, dalla vita fetale all'età adulta. La tecnologia basata sugli organoidi può essere utilizzata per modelli di malattie in vitro, test sui farmaci o terapia cellulare. L'applicazione di regole conformi alle GMP rende la traduzione clinica più vicina.
Pediatric and fetal gastrointestinal organoids: three-dimensional cultures for in vitro disease modelling
Aims Adult COVID-19 is mainly respiratory illness, but in children GI symptoms are more frequent. Furthermore, fetuses are rarely affected by COVID-19. Organoids are a relatively new tool to in vitro establish long-living culture that three-dimensionally resemble the tissue of origin and may both maintain the stemness and fully differentiate in all cell types. As a proof of concept, we aimed to develop a culture system for gastrointestinal organoids (GIOs) to investigate SARS-CoV-2 infection in gastric epithelium across the lifespan. Methods GIO were derived from 8-21 week fetuses and from pediatric and adult tissues. They were cultured using chemically-defined medium, to test their ability to maintain stemness and to fully differentiate. GIO were analyzed in correlation to the surrounding ECM. Reverse cellular polarity Organoids (RP-GOs) were induced and incubated with SARS-CoV-2. All experiments were analyzed by qPCR, immunofluorescence and qualitative analysis as appropriate. Results Gastrointestinal organoids can be isolated from all gestational ages, demonstrating normal gastric epithelial morphology and expressing mature gastric cell types including, the niche, secretive, and enteroendocrine cells. These cultures may be maintained indefinitely in vitro and cultured in GMP-compliant conditions. RP-GOs exhibit apical-out polarity, exposing ACE2 on the external surface, optimizing conditions for viral infection. Viral nucleoprotein was demonstrated in cells undergoing apoptosis, with pediatric RP-GOs most susceptible and efficiently infected compared to fetal and adult organoids. Conclusions We have successfully established an efficient gastrointestinal organoid culture systems for all ages, from fetal life to adulthood. Organoid-based technology can be used for in vitro disease modelling, drug testing or cell therapy. The application of GMP compliant rules makes the clinical translation closer.
Organoidi gastrointestinali pediatrici e fetali: modello di cultura tridimensionale in vitro / Zambaiti, Elisa. - (2022 Mar 09).
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Descrizione: Pediatric and Fetal Gastrointestinal Organoids: three-dimensional cultures for in vitro disease modelling
Tipologia: Tesi di dottorato
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