I correttori del CFTR come nuovo approccio farmacologico per le sarcoglicanopatie

Le sarcoglicanopatie o LGMDR3-6 sono rare malattie autosomiche recessive incurabili che colpiscono principalmente i muscoli prossimali degli arti. L'esordio avviene in età infantile, la malattia è progressiva, costringendo molto spesso i soggetti alla sedia a rotelle. Sono note anche forme più lievi con esordio tardivo e lenta progressione. Le sarcoglicanopatie sono causate da mutazioni nei geni codificanti i sarcoglicani (SG). I SG sono quattro glicoproteine che formano un tetramero nel muscolo scheletrico e cardiaco, localizzato nel sarcolemma, cruciale nella protezione della membrana dallo stress meccanico dovuto alla contrazione muscolare. È stato osservato che le mutazioni missenso, che rappresentano la maggior parte dei casi riportati, producono una proteina con un “folding” difettoso che, anche se potenzialmente funzionale, viene riconosciuta e degradata dal sistema di controllo qualità della cellula. A causa della mancanza di una subunità, il complesso del SG viene distrutto e la conseguente perdita di funzione determina danni al sarcolemma con progressiva degenerazione muscolare. Per contrastare questo processo, il nostro approccio intende aiutare il corretto ripiegamento dei SG utilizzando piccole molecole sviluppate per correggere la proteina CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator) che quando mutato può presentare difetti nel ripiegamento e nella corretta localizzazione. L’efficacia di alcuni correttori del CFTR nel recupero di diversi mutanti del SG è stata provata utilizzando modelli cellulari e cellule miogeniche provenienti da pazienti LGMDR3. Usando queste cellule abbiamo qui verificato l’uso combinato dei correttori ottenendo un effetto additivo o addirittura sinergico. Inoltre, grazie alla disponibilità di cellule miogeniche di un soggetto LGMDR4, abbiamo provato l’efficacia dei correttori del CFTR nelle altre forme di sarcoglicanopatia. Infine, una volta valutato l’effetto dei correttori in vitro, era necessario validare l'efficacia in vivo. A questo scopo e per superare l'inadeguatezza dei modelli murini di sarcoglicanopatia esistenti abbiamo generato un nuovo modello di LGMDR3, caratterizzato da arti posteriori umanizzati, esprimenti la sequenza umana di α-SG. La sequenza umana, wild-type o mutata, è stata trasdotta con il virus adeno-associato di sierotipo 1 (AAV1). La trasduzione è stata effettuata nel background dei topi sgca-null neonati che non presentano il gene dell’α-SG murino che viene così rimpiazzato dalla proteina umana veicolata dal virus. La precoce trasduzione assicura che il muscolo si sviluppi in presenza del sarcoglicano umano, wild-type o mutato, e che insorga tolleranza immunologica verso il transgene. I topi con arti posteriori umanizzati esprimenti l’α-SG con la mutazione R98H hanno sviluppato e riprodotto con alta fedeltà la patologia umana. Di conseguenza, sono stati utilizzati per testare l'efficacia del correttore del CFTR più promettente, il C17, secondo i dati raccolti in vitro. La somministrazione sistemica in cronico della molecola C17 ha reindirizzato con successo il complesso del SG al sarcolemma, inducendo un forte miglioramento del fenotipo distrofico. È importante sottolineare che la forza dei muscoli dei topi trattati ha raggiunto livelli quasi identici a quelli di muscoli WT. Inoltre, la preliminare caratterizzazione farmacocinetica in vitro della molecola C17 ha evidenziato un’ampia stabilità nel sangue e la resistenza alla metabolizzazione da parte dei citocromi P450 (CYP) e dagli UDP glucuronosiltransferasi (UGT), enzimi presenti nei microsomi estratti da fegato murino. Complessivamente, i dati in vitro ed in vivo sono il “proof of concept” dell’efficacia del C17 nei casi di LGMDR3, e aprono nuove possibilità di intervento terapeutico per tutte le forme di sarcoglicanopatia caratterizzate da mutazione missenso.

Sarcoglycanopathies or LGMDR3-6 are rare autosomal recessive disease, affecting mainly the limb proximal musculature that are still without a cure. The onset occurs in childhood, the disease is progressive, very often forcing affected subjects to the wheelchair, even though mild forms may present with late onset and slow progression. Sarcoglycanopathies are caused by mutations in genes coding for sarcoglycans (SG). SG are four glycoproteins forming a tetramer in skeletal and cardiac muscle, located at the sarcolemma that plays a crucial role in protecting the membrane from damages due to muscle contraction. It has been observed that missense mutations, the majority of the reported cases, result in a folding defective, even though potentially functional protein, that is recognized and prematurely discarded by the cell quality control (QC). Lacking one subunit, the SG-complex is disrupted, and the consequent loss of function leads to progressive muscle degeneration. To counteract this harmful process, we proposed to help SGs folding using small molecules, called CFTR correctors, developed to correct mutated cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) channel, defective in folding and trafficking. The effective rescue of different SG mutants has been proved for some of such molecules by using cell models and, importantly, myogenic cells from LGMDR3 patients. In these pathological cells we evidenced the possibility to combine correctors to gain an additive or even synergic effect in LGMDR3 myotubes. Furthermore, thanks to the availability of myogenic cells from a LGMDR4 subject, we had the possibility to verify the efficacy of CFTR correctors in the other forms of sarcoglycanopathy. Lastly, once correctors have been successfully tested in vitro, there was the need for animal models in which proving efficacy and safety of this pharmacological approach. To this intent and to overcome the unsuitability of the already existing sarcoglycanopathy murine models, we generated a novel mouse model of LGMDR3. This model is characterized by humanized hind limbs, resulting from the injection of the human α-SG sequence, either wild-type or carrying a missense mutation, via adeno associated virus 1 (AAV1). The transduction was performed in the background of sgca-null newborn mice to assure muscle development in the presence of either the wild-type or mutated human protein and to induce tolerance toward the transgene. Mice expressing R98H α-SG in hind limbs, well mimicking the human pathologic phenotype, were used to test the efficacy of the most promising, according to in vitro data, CFTR corrector, C17. The systemic and chronic administration of the C17 molecule successfully rerouted the SG-complex containing the human α-SG R98H mutant to the sarcolemma, with a clear amelioration of the dystrophic phenotype. Notably, the force of the C17 treated muscle was fully recovered, reaching levels almost identical to the WT, healthy muscles. In addition, the preliminary C17 pharmacokinetic characterization evidenced a large blood stability, in in vitro experiments, and the resistance to metabolization from both cytochromes P450 (CYPs) and UDP glucuronosyltransferases (UGTs), enzymes present in extracted liver microsomes. Altogether, the in vitro and in vivo data, are the proof of concept of C17 efficacy in LGMDR3 cases, opening a new way of therapeutic intervention for the forms of sarcoglycanopathy characterized by missense mutation.