Caratterizzazione della proteasi termostabile AprX in ceppi di Pseudomonas fluorescens e impatto sulla shelf-life dei prodotti lattiero-caseari: risultati preliminari

L’attività di proteasi termostabili è stata indicata quale responsabile di degradazione di prodotti lattiero-caseari (quale la gelificazione del latte UHT) con ripercussioni sulla durata della shelf-life. Tra le proteasi batteriche coinvolte nei processi di spoilage un ruolo predominante sembra averlo la metallo-proteasi termostabile AprX prodotta da diversi ceppi appartenenti alla specie Pseudomonas fluorescens. La proteasi AprX, prodotta e rilasciata dai batteri nel latte, essendo resistente al calore (come pure le proteasi endogene del latte) è in grado di mantenere inalterata la propria attività enzimatica anche dopo i trattamenti termici che il latte può subire durante la trasformazione (pastorizzazione, trattamento UHT, caseificazione). Diversi studi hanno identificato e caratterizzato la proteina AprX e il gene che la codifica. Differenze nell’attività enzimatica di AprX in ceppi diversi sono state evidenziate, tuttavia quali siano i ceppi maggiormente produttori non è ancora stato chiarito soprattutto in quanto i metodi di identificazione dei ceppi batterici di P. fluorescens basati su caratteristiche fenotipiche non sono molto discriminanti. Nel presente studio sono stati valutati per la presenza del gene aprX 68 ceppi isolati da matrici alimentari e 18 ceppi di referenza appartenenti al gruppo P. fluorescens, precedentemente tipizzati mediante metodica multilocus sequence typing. Successivamente, un gruppo di ceppi di referenza sono stati inoculati in latte e l’espressione del gene aprX è stata valutata a 22 e a 5°C. Sugli stessi campioni di latte è stata quindi valutata l’attività proteolitica mediante due diversi saggi: 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), con il quale si valuta la quantità di aminoacidi liberi; e il test azocaseina, che valuta direttamente l’attività proteolitica mediante un saggio colorimetrico. Infine, per valutare l’applicabilità del saggio azocaseina direttamente su un prodotto lattiero-caseario si è scelta la ricotta industriale. La ricotta industriale viene prodotta utilizzando materie prime (siero di latte e panna) che spesso presentano alte cariche microbiche di P. fluorescens. L’allungamento della shelf-life della ricotta industriale è strettamente legata alla qualità delle materie prime utilizzate soprattutto a causa di spore ed enzimi termostabili che resistono al processo di produzione. La presenza di P. fluorescens e di AprX è stata quindi valutata nelle materie prime (siero di latte e panna) e l’attività proteolitica è stata valutata nella ricotta mediante il saggio azocaseina. I nostri risultati dimostrano la diffusione del gene aprX e della proteina AprX nella maggior parte dei ceppi analizzati e l’applicabilità dei saggi TNBS e azocaseina per monitorare l’attività proteolitica nei prodotti lattiero caseari.